艾纳香叶废渣乙酸乙酯部位对佐剂类风湿关节炎大鼠药理作用研究(1)
[摘要]目的：研究艾纳香叶废渣乙酸乙酯部位(BBE)对大鼠实验性佐剂类风湿关节炎的作用及其机制。方法：用弗氏完全佐剂建立佐剂型类风湿关节炎大鼠模型，用废渣乙酸乙酯部位不同剂量进行28 d的灌胃治疗处理，以体重变化、足肿胀度、关节炎指数、免疫器官增生以及病理切片等来评价治疗效果，并同时用比色法测定血清中的SOD，MDA，GSH，NO，OH·，ALP，AST，ALT，NAG，SA水平以及采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血浆中IL-1，IL-6，TNF-α水平。结果：其乙酸乙酯部位能显著减轻AA大鼠关节肿胀和关节炎指数， 能有效抑制关节滑膜增生，下调血清中MDA，NO，OH·，ALP，AST，ALT，NAG，SA，IL-1，IL-6，TNF-α水平，上调SOD，GSH水平。结论：艾纳香叶废渣乙酸乙酯部位对类风湿关节炎有一定的治疗作用。
[关键词]艾纳香；废渣；乙酸乙酯部位；佐剂型类风湿关节炎
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、进行性、以侵犯全身关节为主要特征的免疫性疾病，是一种常见的风湿性疾病。其发病率约为0.8%(0.3%～2.1%)，女性发病率约是男性的3倍，家谱分析提示，患者具有遗传素质，可能与HLAD和DW抗原等相关。 然而其病因尚不清楚[1]，其主要病理特点是：骨膜慢性炎症、软骨吸收、骨破坏和骨纤维化。多种炎症因子和细胞因子与RA密切相关，迄今尚无疗效确切的药物。
, 百拇医药
艾纳香是菊科植物艾纳香Blumea balsamifera (L.) DC.新鲜或干燥地上部分[2]。全草含挥发油，主要成分为左旋龙脑[3]，现栽培于贵州、云南、广西，是苗、壮族的重要药物，具有祛风除湿、温中止泻、活血解毒、镇痛发汗、祛痰止咳、通经止血等功效[4]。近年来国内外对艾纳香的报道大多围绕艾纳香的温中止血功效探讨其妇科用药的作用机制[5-6]，而艾纳香祛风除湿功效对治疗风湿关节炎方面的影响却鲜有报道。但是民间验方中却屡次出现艾纳香治疗风湿关节炎的案例，且效果确切。
艾纳香为制取艾片的重要原料，主产区通常采其鲜叶和嫩枝用传统的土制水蒸气蒸馏法提取“艾粉”(为艾纳香制取冰片的粗级产品)，再经提炼后可制得精制“艾片(天然左旋冰片)”。产地加工往往将提取“艾粉”后的叶子残渣丢弃，影响了其资源的有效利用。相关试验对艾纳香叶制取挥发油后的废渣进行了药理活性研究，探讨了其不同极性部位镇痛抗炎止血活性的差异，试验证明废渣乙酸乙酯部位有较强的活性。本文根据之前的研究结果进一步阐明废渣乙酸乙酯部位对类风湿关节炎的治疗效果，并初步阐明其机制。
, 百拇医药
1 材料
1.1 药物 艾纳香干燥的叶，采自贵州罗甸。由南京中医药大学陈建伟教授鉴定为菊科植物艾纳香B. balsamifera叶。经水蒸气蒸馏法提取挥发油之后，收集叶的废渣，烘干备用。
1.2 试剂 弗氏完全佐剂(FCA，美国Sigma公司)；吲哚美辛(美国Sigma公司)；50%，95%乙醇，乙酸乙酯均为分析纯；ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.3 动物 清洁级SD雄性大鼠，体重(180±5) g，扬州大学比较医学中心，许可证号SUXR(苏)2012-0004。
2 方法
2.1 供试液的制备 将1.1项下所收集的叶子废渣以5倍量95%乙醇浸泡3 h，回流提取2 h，重复2次，再以50%乙醇回流提取1次；合并提取液滤液，以旋转蒸发仪浓缩，依次以石油醚、乙酸乙酯萃取，浓缩干燥取其乙酸乙酯部位(BBE)，得率为2.43%，以0.5%CMC-Na稀释成浓度适宜的混悬液备用。
, http://www.100md.com
2.2 动物模型 适应性喂养7 d后，除空白组外大鼠用微量注射器于右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(FCA)0.1 mL，7 d后在尾根部皮下再次注射FCA 0.1 mL加强免疫。约14 d左右可诱发成功佐剂型关节炎模型[7]。
2.3 动物分组和给药 36只大鼠适应性喂养7 d后，随机分为6组，每组6只，根据成年人每日艾纳香的用量(15～30 g)设计大鼠实验用药量，其中人使用的高剂量为大鼠实验用量的中剂量，其中各剂量均未出现大鼠用药死亡的现象。空白对照组(0.5%CMC-Na 10 mL·kg-1)、模型对照组(0.5%CMC-Na 10 mL·kg-1)、阳性对照组(3 mg·kg-1吲哚美辛)及BBE高、中、低剂量(21.6，10.8，5.4 mg·kg-1)组，各组动物均于第2次注射FCA加强免疫后开始灌胃给药，连续给药28 d。
2.4 体重和足肿胀度 于第2次注射FCA加强免疫后开始，每7 d(即给药当天，给药后第7，14，21，28 天)对所有大鼠进行体重检测，观察其体重变化，同时以测量足周长法观察其足肿胀情况。
, 百拇医药
2.5 关节炎指数 FCA所致多发性关节炎一般于注射FCA后10～14 d开始出现， 主要观察各组大鼠4只足爪各关节的肿胀程度。于第2次注射FCA加强免疫后第3天开始，每4 d观察并记录各关节病变，按0～4分评分： 0分，正常；1分，关节稍红肿；2分，关节轻度红、肿、热；3分，关节中度红、肿、热、轻度功能障碍；4分，关节重度红、肿、热、严重功能障碍，不能负重。每只大鼠4只足爪的最大积分为16分。
2.6 脾脏和胸腺指数 免疫28 d后，将各组大鼠都脱颈处死，取出脾脏和胸腺分别称重。脾脏(胸腺)指数(mg·g-1)=脾脏(胸腺)质量/体重。
2.7 病理切片 将大鼠处死后剪下膝关节，置于10%甲醛(福尔马林)中固定。经过2周的脱钙，再进行包埋、切片、苏木素和曙红染色等一系列的处理后制成病理切片，显微镜下观察其滑膜增生、炎症、血翳形成、骨侵蚀等病理情况。, 百拇医药(夏嬿 左坚 李祥 陈建伟)
[关键词]艾纳香；废渣；乙酸乙酯部位；佐剂型类风湿关节炎
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、进行性、以侵犯全身关节为主要特征的免疫性疾病，是一种常见的风湿性疾病。其发病率约为0.8%(0.3%～2.1%)，女性发病率约是男性的3倍，家谱分析提示，患者具有遗传素质，可能与HLAD和DW抗原等相关。 然而其病因尚不清楚[1]，其主要病理特点是：骨膜慢性炎症、软骨吸收、骨破坏和骨纤维化。多种炎症因子和细胞因子与RA密切相关，迄今尚无疗效确切的药物。
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艾纳香是菊科植物艾纳香Blumea balsamifera (L.) DC.新鲜或干燥地上部分[2]。全草含挥发油，主要成分为左旋龙脑[3]，现栽培于贵州、云南、广西，是苗、壮族的重要药物，具有祛风除湿、温中止泻、活血解毒、镇痛发汗、祛痰止咳、通经止血等功效[4]。近年来国内外对艾纳香的报道大多围绕艾纳香的温中止血功效探讨其妇科用药的作用机制[5-6]，而艾纳香祛风除湿功效对治疗风湿关节炎方面的影响却鲜有报道。但是民间验方中却屡次出现艾纳香治疗风湿关节炎的案例，且效果确切。
艾纳香为制取艾片的重要原料，主产区通常采其鲜叶和嫩枝用传统的土制水蒸气蒸馏法提取“艾粉”(为艾纳香制取冰片的粗级产品)，再经提炼后可制得精制“艾片(天然左旋冰片)”。产地加工往往将提取“艾粉”后的叶子残渣丢弃，影响了其资源的有效利用。相关试验对艾纳香叶制取挥发油后的废渣进行了药理活性研究，探讨了其不同极性部位镇痛抗炎止血活性的差异，试验证明废渣乙酸乙酯部位有较强的活性。本文根据之前的研究结果进一步阐明废渣乙酸乙酯部位对类风湿关节炎的治疗效果，并初步阐明其机制。
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1 材料
1.1 药物 艾纳香干燥的叶，采自贵州罗甸。由南京中医药大学陈建伟教授鉴定为菊科植物艾纳香B. balsamifera叶。经水蒸气蒸馏法提取挥发油之后，收集叶的废渣，烘干备用。
1.2 试剂 弗氏完全佐剂(FCA，美国Sigma公司)；吲哚美辛(美国Sigma公司)；50%，95%乙醇，乙酸乙酯均为分析纯；ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.3 动物 清洁级SD雄性大鼠，体重(180±5) g，扬州大学比较医学中心，许可证号SUXR(苏)2012-0004。
2 方法
2.1 供试液的制备 将1.1项下所收集的叶子废渣以5倍量95%乙醇浸泡3 h，回流提取2 h，重复2次，再以50%乙醇回流提取1次；合并提取液滤液，以旋转蒸发仪浓缩，依次以石油醚、乙酸乙酯萃取，浓缩干燥取其乙酸乙酯部位(BBE)，得率为2.43%，以0.5%CMC-Na稀释成浓度适宜的混悬液备用。
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2.2 动物模型 适应性喂养7 d后，除空白组外大鼠用微量注射器于右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(FCA)0.1 mL，7 d后在尾根部皮下再次注射FCA 0.1 mL加强免疫。约14 d左右可诱发成功佐剂型关节炎模型[7]。
2.3 动物分组和给药 36只大鼠适应性喂养7 d后，随机分为6组，每组6只，根据成年人每日艾纳香的用量(15～30 g)设计大鼠实验用药量，其中人使用的高剂量为大鼠实验用量的中剂量，其中各剂量均未出现大鼠用药死亡的现象。空白对照组(0.5%CMC-Na 10 mL·kg-1)、模型对照组(0.5%CMC-Na 10 mL·kg-1)、阳性对照组(3 mg·kg-1吲哚美辛)及BBE高、中、低剂量(21.6，10.8，5.4 mg·kg-1)组，各组动物均于第2次注射FCA加强免疫后开始灌胃给药，连续给药28 d。
2.4 体重和足肿胀度 于第2次注射FCA加强免疫后开始，每7 d(即给药当天，给药后第7，14，21，28 天)对所有大鼠进行体重检测，观察其体重变化，同时以测量足周长法观察其足肿胀情况。
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2.5 关节炎指数 FCA所致多发性关节炎一般于注射FCA后10～14 d开始出现， 主要观察各组大鼠4只足爪各关节的肿胀程度。于第2次注射FCA加强免疫后第3天开始，每4 d观察并记录各关节病变，按0～4分评分： 0分，正常；1分，关节稍红肿；2分，关节轻度红、肿、热；3分，关节中度红、肿、热、轻度功能障碍；4分，关节重度红、肿、热、严重功能障碍，不能负重。每只大鼠4只足爪的最大积分为16分。
2.6 脾脏和胸腺指数 免疫28 d后，将各组大鼠都脱颈处死，取出脾脏和胸腺分别称重。脾脏(胸腺)指数(mg·g-1)=脾脏(胸腺)质量/体重。
2.7 病理切片 将大鼠处死后剪下膝关节，置于10%甲醛(福尔马林)中固定。经过2周的脱钙，再进行包埋、切片、苏木素和曙红染色等一系列的处理后制成病理切片，显微镜下观察其滑膜增生、炎症、血翳形成、骨侵蚀等病理情况。, 百拇医药(夏嬿 左坚 李祥 陈建伟)