白芍总苷对2型糖尿病大鼠肾组织Wnt/β—catenin信号通路表达的影响(1)
[摘要]该实验研究白芍总苷对2型糖尿病大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号通路表达的影响，探讨白芍总苷对糖尿病大鼠肾脏损伤的保护作用及可能机制。实验采用高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导2型糖尿病大鼠，动物分为正常对照组，糖尿病对照组，白芍总苷低、中、高剂量治疗组 (50，100，200 mg·kg-1)及阳性对照组 (雷公藤多苷8 mg·kg-1)，灌胃给药，每日1次，14周末检测大鼠空腹血糖，血肌酐，尿素氮，24 h尿蛋白；光镜观察肾组织形态学的改变；病理图像系统分析平均肾小球面积及平均肾小球体积；免疫组织化学及Western blot检测肾组织Wnt-1，β-catenin蛋白表达；逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肾组织Wnt-1，β-catenin mRNA表达。研究发现高糖高脂诱导的2型糖尿病大鼠肾组织Wnt-1，β-catenin表达增高。与糖尿病对照组比较，各治疗组大鼠血肌酐，尿素氮，24 h尿蛋白，平均肾小球面积，平均肾小球体积显著降低，肾组织病理形态学明显改善；Wnt-1， β-catenin mRNA及蛋白表达显著减少。综上所述，2型糖尿病大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号通路异常活化，白芍总苷可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活化，改善糖尿病大鼠肾脏损害，延缓糖尿病肾病的发生发展。
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[关键词]糖尿病肾病；白芍总苷；Wnt-1；β-catenin
随着人们生活水平的提高，全球糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者已超过1.7亿，无论是1型还是2型DM，大约30%～40%的患者可出现肾脏损害，即糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，是终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)主要原因，约占全部ESRD病例的44%，严重影响患者的生存质量[1]。目前DN的发病机制多认为与细胞内信号转导、免疫反应、代谢紊乱及肾素-血管紧张素系统(RAS)紊乱等有关。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路异常激活可诱导足细胞nephrin分子表达下调和蛋白尿的发生，阻断该通路的表达则会减轻足细胞损伤[2-3]；异常的Wnt通路导致肾小球系膜细胞增殖或肾纤维化，从而影响DN发生发展[4]。药理及临床研究发现白芍总苷(total glucosides of paeony，TGP)具有抗炎、调节免疫、镇痛等功效，近年来白芍总苷已被广泛应用于多种肾脏疾病的临床治疗。经文献检索，国内外尚无文献报道白芍总苷对Wnt/β-catenin通路干预性研究。本文旨在研究白芍总苷对2型糖尿病大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号通路表达的影响，为白芍总苷在临床糖尿病肾病治疗中的应用提供理论及实验依据。
, 百拇医药
1 材料
1.1 动物 90只健康清洁级雄性SD大鼠，体重180～220 g，周龄8周，由蚌埠医学院实验动物中心提供，许可证号SYXK(皖)2012-0002，在蚌埠医学院实验动物中心屏障设施内饲养。
1.2 药品和试剂 白芍总苷，宁波立华制药有限公司，批准文号国药准字H20055058，用前以0.5%羧甲基纤维素钠配制混悬液；羧甲基纤维素钠，湖南尔康制药有限公司；枸橼酸和枸橼酸钠，台山市新宁制药有限公司；链脲佐菌素(STZ)，美国 Sigma公司；强生稳步血糖测定仪及试纸，美国强生公司；兔抗Wnt-1多克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology；鼠抗β-catenin单克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology；免疫组化试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；Western blot相关试剂和RIPA裂解液及BCA蛋白浓度测定试剂盒，江苏碧云天生物研究所公司；Trizol总RNA抽提试剂盒、RT-PCR试剂盒及引物合成，上海生工生物工程有限公司。
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1.3 仪器 ME204电子分析天平(梅特勒托利多仪器有限公司)；LE438酸度计/pH计(梅特勒托利多仪器有限公司)；ZF-90型多功能暗箱式紫外透射仪(上海顾村电光仪器厂)；梯度PCR 扩增仪(德国Biometra Tgradient)；Tanon GIS-3500GIS凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)；DY-A电泳仪(上海生化所申华生化技术开发公司)；DYY-Ⅲ32型琼脂糖水平电泳槽(北京六一仪器厂)；Sanyo Ultra Low NDF-382超低温冰箱(日本)。Eppendorf-5810R冷冻高速离心机(德国)；OLYMPUS 5800型全自动生化分析仪(日本)；OLYMPUS显微镜(BX40)；RM2245切片机(德国LEICA 切片机)。
2 方法
2.1 动物模型建立及分组 8周龄SD雄性大鼠，体重180～220 g，普通饲料适应性喂养1周，采用随机数字表法随机分为糖尿病模型组80只和对照组10只。糖尿病模型组给予高糖高脂饲料(含20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐、66.5%常规饲料)，对照组给予颗粒型普通饲料喂养。糖尿病模型组大鼠高糖高脂饲料喂养4周，禁食12 h后，一次性右下腹腹腔注射由枸橼酸钠溶液(0.1 mol·L-1，pH 4.2)配制的STZ 35 mg·kg-1，诱导2型糖尿病大鼠模型，对照组同时给予等量的枸橼酸钠溶剂。72 h后尾静脉采血，空腹血糖>16.7 mmol·L-1为胰岛素敏感性降低，符合此标准的大鼠确定为2型糖尿病大鼠[5]。6只随机血糖<16.7 mmol·L-1，造模失败，造模过程中3只大鼠死亡，成模71只，随机剔除匹配不均1只。糖尿病模型组随机分为糖尿病组，白芍总苷低、中、高剂量组(50，100，200 mg·kg-1·d-1)，雷公藤多苷组(8 mg·kg-1·d-1)，灌胃8周，糖尿病组及正常对照组给同体积0.5%羧甲基纤维素钠灌胃，整个实验过程总共为14周(适应性喂养1周，高糖高脂饲料诱导4周，造模及检测相关指标约1周，药物干预8周)。实验期间死亡动物剔除，不予统计。, 百拇医药(常保超 陈卫东 张燕 杨萍 刘磊 王静)
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[关键词]糖尿病肾病；白芍总苷；Wnt-1；β-catenin
随着人们生活水平的提高，全球糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者已超过1.7亿，无论是1型还是2型DM，大约30%～40%的患者可出现肾脏损害，即糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，是终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)主要原因，约占全部ESRD病例的44%，严重影响患者的生存质量[1]。目前DN的发病机制多认为与细胞内信号转导、免疫反应、代谢紊乱及肾素-血管紧张素系统(RAS)紊乱等有关。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路异常激活可诱导足细胞nephrin分子表达下调和蛋白尿的发生，阻断该通路的表达则会减轻足细胞损伤[2-3]；异常的Wnt通路导致肾小球系膜细胞增殖或肾纤维化，从而影响DN发生发展[4]。药理及临床研究发现白芍总苷(total glucosides of paeony，TGP)具有抗炎、调节免疫、镇痛等功效，近年来白芍总苷已被广泛应用于多种肾脏疾病的临床治疗。经文献检索，国内外尚无文献报道白芍总苷对Wnt/β-catenin通路干预性研究。本文旨在研究白芍总苷对2型糖尿病大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号通路表达的影响，为白芍总苷在临床糖尿病肾病治疗中的应用提供理论及实验依据。
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1 材料
1.1 动物 90只健康清洁级雄性SD大鼠，体重180～220 g，周龄8周，由蚌埠医学院实验动物中心提供，许可证号SYXK(皖)2012-0002，在蚌埠医学院实验动物中心屏障设施内饲养。
1.2 药品和试剂 白芍总苷，宁波立华制药有限公司，批准文号国药准字H20055058，用前以0.5%羧甲基纤维素钠配制混悬液；羧甲基纤维素钠，湖南尔康制药有限公司；枸橼酸和枸橼酸钠，台山市新宁制药有限公司；链脲佐菌素(STZ)，美国 Sigma公司；强生稳步血糖测定仪及试纸，美国强生公司；兔抗Wnt-1多克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology；鼠抗β-catenin单克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology；免疫组化试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；Western blot相关试剂和RIPA裂解液及BCA蛋白浓度测定试剂盒，江苏碧云天生物研究所公司；Trizol总RNA抽提试剂盒、RT-PCR试剂盒及引物合成，上海生工生物工程有限公司。
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2 方法
2.1 动物模型建立及分组 8周龄SD雄性大鼠，体重180～220 g，普通饲料适应性喂养1周，采用随机数字表法随机分为糖尿病模型组80只和对照组10只。糖尿病模型组给予高糖高脂饲料(含20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐、66.5%常规饲料)，对照组给予颗粒型普通饲料喂养。糖尿病模型组大鼠高糖高脂饲料喂养4周，禁食12 h后，一次性右下腹腹腔注射由枸橼酸钠溶液(0.1 mol·L-1，pH 4.2)配制的STZ 35 mg·kg-1，诱导2型糖尿病大鼠模型，对照组同时给予等量的枸橼酸钠溶剂。72 h后尾静脉采血，空腹血糖>16.7 mmol·L-1为胰岛素敏感性降低，符合此标准的大鼠确定为2型糖尿病大鼠[5]。6只随机血糖<16.7 mmol·L-1，造模失败，造模过程中3只大鼠死亡，成模71只，随机剔除匹配不均1只。糖尿病模型组随机分为糖尿病组，白芍总苷低、中、高剂量组(50，100，200 mg·kg-1·d-1)，雷公藤多苷组(8 mg·kg-1·d-1)，灌胃8周，糖尿病组及正常对照组给同体积0.5%羧甲基纤维素钠灌胃，整个实验过程总共为14周(适应性喂养1周，高糖高脂饲料诱导4周，造模及检测相关指标约1周，药物干预8周)。实验期间死亡动物剔除，不予统计。, 百拇医药(常保超 陈卫东 张燕 杨萍 刘磊 王静)