HPLC—荧光法测定大鼠血浆中4种蒽醌类成分及其药代动力学研究(1)
[摘要]建立大鼠灌服栀子大黄汤后血浆中芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的测定方法并考察4种蒽醌类成分在大鼠体内的药动学行为。采用HPLC-荧光法测定大鼠血浆中4种蒽醌的血药浓度，血浆样品通过液液萃取法进行处理。Phecda C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相0.2%乙酸-甲醇，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1。激发和发射波长分别为430，525 nm，采用DAS 2.0软件对所得的血药浓度进行拟合，求算相应的药动学参数。结果显示4种蒽醌类成分均可被吸收进入体内。大鼠血浆中芦荟大黄素，大黄酸，大黄酚，大黄素甲醚的Cmax分别为(0.085±0.058)，(3.772±1.152)，(0.464±0.267)，(0.028±0.008) mg·L-1；tmax分别为(1.042±0.510)，(0.805±0.307)，(1.167±0.283)，(0.616±0.162) h；t1/2分别为(3.557±1.250)，(6.879±1.126)，(5.196±2.032)，(4.337±1.816) h；AUC0-t分别为(0.504±0.130)，(9.558±1.106)，(2.545±1.554)，(0.052±0.018) mg·h·L-1。该研究建立了一种专属性强，准确度高，灵敏度好的HPLC-荧光法，可适用于4种蒽醌成分的体内浓度测定。
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[关键词]栀子大黄汤；蒽醌；HPLC-荧光法；药代动力学
栀子大黄汤最早记载于《金匮要略》，临床上用于治疗冠心病[1]，急性胰腺炎[2]，黄疸[3]。该方剂由栀子、大黄、枳实和淡豆豉4味药材组成。本课题组前期研究了该方剂的物质基础，及配伍变化对栀子中京尼平苷药动学的影响，定量测定了该方剂中9个特征性成分[4-6]。目前关于栀子大黄汤中蒽醌类成分的药动学研究未见报道。中药体系复杂，其药效可能是多种物质综合产生的结果。对中药的有效成分进行药代动力学研究，可以为中药发挥药效提供一定的科学解释[7-8]。蒽醌类成分因其具有广泛的药理活性被认为是大黄的有效成分[9]，主要包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚。本研究采用HPLC-荧光法测定大鼠血浆中芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚的浓度，首次阐明了大鼠灌服栀子大黄汤后血浆中4种蒽醌类成分的药动学特性，为进一步开展该复方的研究奠定基础。
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1 材料
1.1 药品与试剂 栀子(批号20130301，产地江西)，大黄(批号130322，产地甘肃)，枳实(批号130318，产地江西)，淡豆豉(批号130218，产地河南)，均购于南京先声药店。经中国药科大学中药学院秦民坚教授鉴定，栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥果实；大黄为蓼科植物药用大黄Rheum officinale Baill的干燥根和根茎；枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果；淡豆豉为豆科植物大豆Glycinemax (L.)Merr.的成熟种子的发酵加工品。芦荟大黄素(批号13030701)，大黄酸(批号13031210)，大黄酚(批号13021803)，大黄素甲醚(批号13022005)，均购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度均大于98%。内标1，8-二羟基蒽醌(批号110829)购于中国食品药品检定研究院。甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)；乙酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)；水为娃哈哈纯净水，其他试剂为分析纯。
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1.2 仪器 LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津公司)，AnkeTGL-16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，AB135-S电子天平(梅特勒-托利多)，AEU-210电子天平(日本岛津公司)，XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，高速多功能粉碎机(上海冰都电器有限公司)，RE-52CS型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
1.3 动物 清洁级SD大鼠，雄性，体重(250±10) g，由南京青龙山动物中心提供，动物许可证号SCXK (浙) 2008-0033。饲养温度为20～25 ℃，饲养环境湿度为(45±10)%。
2 方法
2.1 栀子大黄汤(ZZDHD)的制备 取栀子9 g，大黄3 g，枳实12 g，淡豆豉24 g，粉碎，加10倍量水浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮30 min，4层纱布过滤；滤渣重复提取2次，合并3次滤液。滤液经旋转蒸发浓缩后制成ZZDHD冻干粉。栀子大黄汤中4种蒽醌的含量测定参考文献[6]。
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2.2 灌胃及采血 称取ZZDHD冻干粉适量，用0.5%羧甲基纤维素钠配制成栀子大黄汤，生药质量浓度为1.8 g·mL-1，临用前搅拌均匀。灌胃体积为15 mL·kg-1。实验前禁食12 h，自由饮水。给药前采集大鼠的空白血浆，于给药后的0.083，0.167，0.33，0.5，0.75，1，2，4，6，8，12，24 h眼眶采集0.5 mL全血置于肝素化的EP管中。16 000 r·min-1离心10 min取上清，-20 ℃保存至分析。
2.3 血样前处理方法 取200 μL血浆至10 mL刻度离心管，加2 mol·L-1盐酸40 μL及20 μL内标溶液(2.575 mg·L-1)，涡旋1 min，加1 mL乙酸乙酯，涡旋2 min，4 000 r·min-1离心10 min，用1 mL刻度吸量管吸0.75 mL乙酸乙酯层，40 ℃水浴条件下N2吹干，残渣用100 μL甲醇复溶，涡旋1 min，16 000 r·min-1离心10 min，取上清液20 μL进样分析。, 百拇医药(黄金秋 严雪梅 冯芳)
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[关键词]栀子大黄汤；蒽醌；HPLC-荧光法；药代动力学
栀子大黄汤最早记载于《金匮要略》，临床上用于治疗冠心病[1]，急性胰腺炎[2]，黄疸[3]。该方剂由栀子、大黄、枳实和淡豆豉4味药材组成。本课题组前期研究了该方剂的物质基础，及配伍变化对栀子中京尼平苷药动学的影响，定量测定了该方剂中9个特征性成分[4-6]。目前关于栀子大黄汤中蒽醌类成分的药动学研究未见报道。中药体系复杂，其药效可能是多种物质综合产生的结果。对中药的有效成分进行药代动力学研究，可以为中药发挥药效提供一定的科学解释[7-8]。蒽醌类成分因其具有广泛的药理活性被认为是大黄的有效成分[9]，主要包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚。本研究采用HPLC-荧光法测定大鼠血浆中芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚的浓度，首次阐明了大鼠灌服栀子大黄汤后血浆中4种蒽醌类成分的药动学特性，为进一步开展该复方的研究奠定基础。
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1 材料
1.1 药品与试剂 栀子(批号20130301，产地江西)，大黄(批号130322，产地甘肃)，枳实(批号130318，产地江西)，淡豆豉(批号130218，产地河南)，均购于南京先声药店。经中国药科大学中药学院秦民坚教授鉴定，栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥果实；大黄为蓼科植物药用大黄Rheum officinale Baill的干燥根和根茎；枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果；淡豆豉为豆科植物大豆Glycinemax (L.)Merr.的成熟种子的发酵加工品。芦荟大黄素(批号13030701)，大黄酸(批号13031210)，大黄酚(批号13021803)，大黄素甲醚(批号13022005)，均购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度均大于98%。内标1，8-二羟基蒽醌(批号110829)购于中国食品药品检定研究院。甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)；乙酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)；水为娃哈哈纯净水，其他试剂为分析纯。
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1.2 仪器 LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津公司)，AnkeTGL-16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，AB135-S电子天平(梅特勒-托利多)，AEU-210电子天平(日本岛津公司)，XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，高速多功能粉碎机(上海冰都电器有限公司)，RE-52CS型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
1.3 动物 清洁级SD大鼠，雄性，体重(250±10) g，由南京青龙山动物中心提供，动物许可证号SCXK (浙) 2008-0033。饲养温度为20～25 ℃，饲养环境湿度为(45±10)%。
2 方法
2.1 栀子大黄汤(ZZDHD)的制备 取栀子9 g，大黄3 g，枳实12 g，淡豆豉24 g，粉碎，加10倍量水浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮30 min，4层纱布过滤；滤渣重复提取2次，合并3次滤液。滤液经旋转蒸发浓缩后制成ZZDHD冻干粉。栀子大黄汤中4种蒽醌的含量测定参考文献[6]。
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2.2 灌胃及采血 称取ZZDHD冻干粉适量，用0.5%羧甲基纤维素钠配制成栀子大黄汤，生药质量浓度为1.8 g·mL-1，临用前搅拌均匀。灌胃体积为15 mL·kg-1。实验前禁食12 h，自由饮水。给药前采集大鼠的空白血浆，于给药后的0.083，0.167，0.33，0.5，0.75，1，2，4，6，8，12，24 h眼眶采集0.5 mL全血置于肝素化的EP管中。16 000 r·min-1离心10 min取上清，-20 ℃保存至分析。
2.3 血样前处理方法 取200 μL血浆至10 mL刻度离心管，加2 mol·L-1盐酸40 μL及20 μL内标溶液(2.575 mg·L-1)，涡旋1 min，加1 mL乙酸乙酯，涡旋2 min，4 000 r·min-1离心10 min，用1 mL刻度吸量管吸0.75 mL乙酸乙酯层，40 ℃水浴条件下N2吹干，残渣用100 μL甲醇复溶，涡旋1 min，16 000 r·min-1离心10 min，取上清液20 μL进样分析。, 百拇医药(黄金秋 严雪梅 冯芳)