麦冬不同种群遗传多样性的RSAP分析(1)
[摘要]利用RSAP标记技术对120份不同地理来源的麦冬种质资源进行多样性分析，结果表明：筛选出的16对引物组合共扩增出326条带，其中318条多态性条带，多态性比率为97.55%，多态性含量PIC在0.87～0.95，平均0.92，表明试供材料间在分子水平上具有丰富的遗传多样性。种群遗传多样性结果表明，20个种群多态性位点比例(PPL)为19.94%～85.58%，Nei′s基因多样性指数(H)和Shannon信息指数(I)分别在0.082 6～0.210 7，0.120 6～0.328 1，其中浙麦冬遗传多样性最高，矮小山麦冬遗传多样性最低。种群遗传距离在0.024 6～0.286 8，浙江山麦冬和浙江阔叶山麦冬遗传距离最小，福建短葶山麦冬和沿阶草遗传距离最大。20个自然种群间基因分化系数(Gst)为0.430 7，种群间遗传变异占总遗传变异的43.07%，种群内变异为56.93%，基因流(Nm)为0.660 9。UPMGA聚类分析与主坐标分析结果基本一致，120份样本被分成四大类，聚类结果与形态分类基本一致，同时与地理来源也有很高的的一致性。
, 百拇医药
[关键词]麦冬；RSAP标记；遗传多样性分析；主坐标分析
麦冬是指以“麦冬”为名的百合科山麦冬属Liriope Lour和沿阶草属Ophiopogon Ker-gawl部分植物的统称，广泛分布于东南亚国家。麦冬是重要的药用植物，主要药用成分甾体皂苷用于治疗心肌缺血、血栓、降血糖等疾病[1-2]；同时一些麦冬品种具有四季常绿，易繁殖等特点，其抗逆性和生态效益优于其他草坪[3]，被广泛用于园林植被和观赏植物。
近年来，利用分子标记技术研究麦冬种质资源的鉴定和亲缘关系逐渐展开。张君毅等[4-5]用TRAP和SRAP标记初步研究了短葶山麦冬的遗传多样性，结果表明短葶山麦冬遗传多样性水平较高，并且出现了一定的遗传分化。Li和Park基于RAPD扩增结果[6]，获得了4对SCAR引物，用来区分开山麦冬属和沿阶草属。黄玉吉等[7]使用RAPD标记分析34个自然种群麦冬的遗传多样性并构建分子指纹图谱，结果表明麦冬遗传差异明显，具有丰富的遗传多样性。多种分子标记结果显示麦冬基因型上具有丰富的遗传多样性，遗传差异明显。但由于样本数量和来源存在差异，导致研究结果略有差异，同时由于取样数量少，取样范围狭小，取样多为栽培种，研究结果不具有很好的代表性。
, 百拇医药
限制性位点扩增多态性(restriction site amplification polymorphism，RSAP)标记，是针对基因组中酶切位点进行引物设计，通过简单的梯度PCR反应来产生多态性，具有成本低、结果稳定可靠等优点，已成功用于遗传距离估算、遗传连锁图谱构建、QTL定位等方面[8-9]，目前在海带、红花檵木、重楼属和紫菜等[10-13]有相关报道。
本研究扩大试验样本数量，扩宽采样范围，采集野生样本，采用RSAP标记对120份野生样本进行遗传多样性分析，旨在揭示麦冬亲缘关系、遗传多样性和遗传分化程度，为麦冬种质资源的开发利用和新品种的选育提供分子水平的理论依据。
1 材料
20个种群120份野生麦冬于2010—2011年采集，经福建省厦门华侨引种园张永田研究员鉴定后，种植于华侨大学麦冬种质资源圃，采集信息见表1。PCR扩增试剂均购自Takara公司，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，其他试剂由上海生物工程技术服务有限公司提供。
, 百拇医药
2 方法
2.1 DNA提取 采用改良的CTAB法提取麦冬基因组DNA[14]，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，同时用超微量紫外分光光度计测DNA浓度，-20 ℃保存备用。
2.2 PCR扩增 RSAP引物参考杜晓华等[15]的研究，设计合成10条引物，见表2。引物由上海英潍捷基公司合成。RSAP反应体系20 μL，包含10×PCR Buffer(含Mg2+浓度为15 mmol·L-1)，dNTP 0.2 mmol·L-1，引物浓度为0.6 μmol·L-1，Taq酶为1.0 U，DNA模板量为40 ng。PCR扩增在东胜创新基因扩增仪EDC-810上进行，反应程序为94 ℃预变性4 min；反应前5个循环，94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；反应后30个循环，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物以1×TBE为缓冲液，进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用快速银染法染色[16]。
2.3 数据统计与分析 根据电泳图谱结果，在相同迁移位置上，有带标记1，无带标记为0，构成遗传相似矩阵。使用Popgene 32软件对遗传参数进行分析。使用NTSYS 2.10e软件，用类平均法(UPGMA)进行聚类分析和主坐标分析。多态信息量(polymorphism information content，PIC)按照公式(1)计算[17]，Pij表示标记i第j种带型出现的频率，标记i的带型数从1到n，PIC的范围为0～1，0代表无多态性，1代表具有丰富的多态性。引物分辨力(resolving power，RP)按公式(2)计算[18]，其中Ib(information band)计算公式为Ib=1-(2×|0.5-Pi|)，Pi代表样本第i个扩增位点所占的比例。, 百拇医药(徐护朝 张君毅 司灿)
, 百拇医药
[关键词]麦冬；RSAP标记；遗传多样性分析；主坐标分析
麦冬是指以“麦冬”为名的百合科山麦冬属Liriope Lour和沿阶草属Ophiopogon Ker-gawl部分植物的统称，广泛分布于东南亚国家。麦冬是重要的药用植物，主要药用成分甾体皂苷用于治疗心肌缺血、血栓、降血糖等疾病[1-2]；同时一些麦冬品种具有四季常绿，易繁殖等特点，其抗逆性和生态效益优于其他草坪[3]，被广泛用于园林植被和观赏植物。
近年来，利用分子标记技术研究麦冬种质资源的鉴定和亲缘关系逐渐展开。张君毅等[4-5]用TRAP和SRAP标记初步研究了短葶山麦冬的遗传多样性，结果表明短葶山麦冬遗传多样性水平较高，并且出现了一定的遗传分化。Li和Park基于RAPD扩增结果[6]，获得了4对SCAR引物，用来区分开山麦冬属和沿阶草属。黄玉吉等[7]使用RAPD标记分析34个自然种群麦冬的遗传多样性并构建分子指纹图谱，结果表明麦冬遗传差异明显，具有丰富的遗传多样性。多种分子标记结果显示麦冬基因型上具有丰富的遗传多样性，遗传差异明显。但由于样本数量和来源存在差异，导致研究结果略有差异，同时由于取样数量少，取样范围狭小，取样多为栽培种，研究结果不具有很好的代表性。
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限制性位点扩增多态性(restriction site amplification polymorphism，RSAP)标记，是针对基因组中酶切位点进行引物设计，通过简单的梯度PCR反应来产生多态性，具有成本低、结果稳定可靠等优点，已成功用于遗传距离估算、遗传连锁图谱构建、QTL定位等方面[8-9]，目前在海带、红花檵木、重楼属和紫菜等[10-13]有相关报道。
本研究扩大试验样本数量，扩宽采样范围，采集野生样本，采用RSAP标记对120份野生样本进行遗传多样性分析，旨在揭示麦冬亲缘关系、遗传多样性和遗传分化程度，为麦冬种质资源的开发利用和新品种的选育提供分子水平的理论依据。
1 材料
20个种群120份野生麦冬于2010—2011年采集，经福建省厦门华侨引种园张永田研究员鉴定后，种植于华侨大学麦冬种质资源圃，采集信息见表1。PCR扩增试剂均购自Takara公司，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，其他试剂由上海生物工程技术服务有限公司提供。
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2 方法
2.1 DNA提取 采用改良的CTAB法提取麦冬基因组DNA[14]，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，同时用超微量紫外分光光度计测DNA浓度，-20 ℃保存备用。
2.2 PCR扩增 RSAP引物参考杜晓华等[15]的研究，设计合成10条引物，见表2。引物由上海英潍捷基公司合成。RSAP反应体系20 μL，包含10×PCR Buffer(含Mg2+浓度为15 mmol·L-1)，dNTP 0.2 mmol·L-1，引物浓度为0.6 μmol·L-1，Taq酶为1.0 U，DNA模板量为40 ng。PCR扩增在东胜创新基因扩增仪EDC-810上进行，反应程序为94 ℃预变性4 min；反应前5个循环，94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；反应后30个循环，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物以1×TBE为缓冲液，进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用快速银染法染色[16]。
2.3 数据统计与分析 根据电泳图谱结果，在相同迁移位置上，有带标记1，无带标记为0，构成遗传相似矩阵。使用Popgene 32软件对遗传参数进行分析。使用NTSYS 2.10e软件，用类平均法(UPGMA)进行聚类分析和主坐标分析。多态信息量(polymorphism information content，PIC)按照公式(1)计算[17]，Pij表示标记i第j种带型出现的频率，标记i的带型数从1到n，PIC的范围为0～1，0代表无多态性，1代表具有丰富的多态性。引物分辨力(resolving power，RP)按公式(2)计算[18]，其中Ib(information band)计算公式为Ib=1-(2×|0.5-Pi|)，Pi代表样本第i个扩增位点所占的比例。, 百拇医药(徐护朝 张君毅 司灿)