豆豉姜的生物碱类成分研究(1)
[摘要]作为2015版《中国药典》项目——豆豉姜的质量标准增订工作的一部分，本研究对豆豉姜进行了化学成分研究。利用硅胶、Sephadex LH-20、ODS等色谱技术分离得到了7个异喹啉生物碱，并通过MS，1D和2D NMR波谱数据分析及与文献相比对等方法，分别鉴定为(+)-去甲波尔定(1)、(+)-波尔定(2)、(+)-瑞枯灵(3)、(+)-六驳碱(4)、(+)-异波尔定(5)、(+)-N-甲基六驳碱(6)、小檗碱(7)，其中化合物7为首次从本属中分离得到。利用BV-2和RAW264.7细胞炎症模型评价其体外抗炎作用，化合物1，2，5和7显示中度至微弱的活性。
[关键词]豆豉姜；山鸡椒；生物碱；抗炎活性
豆豉姜为樟科Lauraceae木姜子属植物山鸡椒Litsea cubeba (Lour) Pers.的根及根茎，具有祛风除湿，理气止痛之功效，传统用于风湿痹痛、跌打损伤、感冒、心胃冷痛、腹痛吐泻等证，在我国南方多个省份广泛应用 [1]。豆豉姜是中国药典(2010版)收载的云香祛风止痛酊(云香精)、正骨水和珍珠胃安丸等多个成方制剂的组成药物之一[2]。
, 百拇医药
豆豉姜主要含异喹啉类生物碱、木脂素等酚类成分和挥发油类，而阿朴菲生物碱被认为是代表性成分[1]。现代药理学研究显示豆豉姜在心脑血管疾病、抗肿瘤、抗炎免疫、平喘抗过敏、抗氧化、抗菌、杀虫等方面都有较好的作用，特别是对弗氏完全佐剂诱导的关节炎大鼠产生良好的效果[3]。但目前对豆豉姜的药效物质仍不明确，且良好的传统用药效果和临床应用也亟需建立相应的质量评价方法。作为2015年版《中国药典》——豆豉姜的质量标准增订项目的一部分，本研究对豆豉姜生物碱进行了分离鉴定，并对所获得的单体化合物进行了体外抗炎活性研究，以期为阐明豆豉姜的药效物质和建立科学的质量评价方法提供依据。
1 材料
1.1 药材 豆豉姜药材于2012年8月采自广东省肇庆市怀集县，经北京中医药大学中药学院张媛副教授鉴定为樟科植物山鸡椒L. cubeba的根、根茎和茎的混合品，凭证标本(No. LC201210)存放于北京中医药大学中药现代研究中心。
, 百拇医药
1.2 细胞 BV-2小胶质细胞系由中国医学科学院细胞中心提供；小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系购自上海细胞所。
1.3 仪器和试剂 Varian Inova-500型核磁共振仪；Waters Xevo G2 Q-TOF型质谱仪；美国鲁道夫Autopol IV型旋光仪；Sephadex LH-20 GE(Heatcare，瑞典)；ODS(40～63 μm)(Merck，德国)；柱色谱硅胶(200～300目)及薄层色谱硅胶板GF254(青岛海洋化工厂产品)；提取和分离中所用化学试剂均为分析纯(北京化工厂)；SANYO MCO-18AIC细胞培养箱；Motic AE2000倒置荧光显微镜；ESCO OptiMair超净工作台；瑞士TECAN M1000型多功能酶标仪；DMEM培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；NO化学法试剂盒(南京建成生物公司)；阳性对照为槲皮素和姜黄素(Sigma，美国)。
2 提取与分离
, 百拇医药
干燥豆豉姜药材50 kg，用10倍量95%乙醇(加0.5%盐酸调pH 2.0)提取2次，75%乙醇提取1次，每次2 h。合并提取液减压回收乙醇后得到总浸膏，以氯仿萃取得到氯仿部位(290 g)，水层加NH3·H2O调pH 10，以正丁醇萃取，得到正丁醇部位(980 g)。
正丁醇部位(950 g)经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇(30∶1～0∶1)梯度洗脱，得到18个流分(LB1～18)。LB13经硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯-甲醇-三乙胺(4∶1∶0.01)洗脱，再经Sephadex LH-20(甲醇)纯化，得到化合物1(11 g)。LB10经硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯-甲醇(10∶1)洗脱，得到12个流分(LB10A～L)。LB10E经ODS柱(甲醇-水 40∶60)分离和Sephadex LH-20(甲醇)纯化，得到化合物2(12 g)和化合物3(5 g)。LB10I经ODS柱(甲醇-水 40∶60)分离和Sephadex LH-20(甲醇)纯化，得到化合物4(10.5 g)。LB10H经多次硅胶柱色谱和ODS柱色谱(甲醇-水 50∶50)分离，并经Sephadex LH-20(甲醇)纯化，得到化合5(580 mg)。LB6经硅胶柱色谱分离，氯仿-丙酮-三乙胺(4∶1∶0.015)洗脱，得到4个流分(LB6A～D)；LB6B经Sephadex LH-20(甲醇)纯化，再经ODS(甲醇∶水∶三乙胺1∶1∶0.025)纯化，得到化合物6(3 g)。LB12经硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯-甲醇-二乙胺(8∶1∶0.045)洗脱，得到化合物7(50 mg)。
, 百拇医药
3 结构鉴定
化合物1 灰棕色粉末，碘化铋钾反应阳性；[α]25D +71.5(c 0.08，CH3OH)；ESI-MS m/z 314[M+H]+；1 H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ： 6.52(1H，s，H-3)，2.73(1H，m，Ha-4)，2.56(1H，dd，J=14.0，4.0，Hb-4)，3.10(1H，dd，J=14.0，4.0，Ha-5)，2.73(1H，m，Hb-5)，3.51(1H，dd，J=14.0，4.5，H-6a)，2.44(2H，m，H-7)，6.70(1H，s，H-8)，7.87(1H，s，H-11)，3.58(3H，s，1-OCH3)，3.77(3H，s，10-OCH3)；13C-NMR数据见表1。以上数据与文献[4]对照一致，鉴定为(+)-去甲波尔定，见图1。, 百拇医药(张水英 郭强 曹愿 张媛 高小力 屠鹏飞 柴兴云)
[关键词]豆豉姜；山鸡椒；生物碱；抗炎活性
豆豉姜为樟科Lauraceae木姜子属植物山鸡椒Litsea cubeba (Lour) Pers.的根及根茎，具有祛风除湿，理气止痛之功效，传统用于风湿痹痛、跌打损伤、感冒、心胃冷痛、腹痛吐泻等证，在我国南方多个省份广泛应用 [1]。豆豉姜是中国药典(2010版)收载的云香祛风止痛酊(云香精)、正骨水和珍珠胃安丸等多个成方制剂的组成药物之一[2]。
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豆豉姜主要含异喹啉类生物碱、木脂素等酚类成分和挥发油类，而阿朴菲生物碱被认为是代表性成分[1]。现代药理学研究显示豆豉姜在心脑血管疾病、抗肿瘤、抗炎免疫、平喘抗过敏、抗氧化、抗菌、杀虫等方面都有较好的作用，特别是对弗氏完全佐剂诱导的关节炎大鼠产生良好的效果[3]。但目前对豆豉姜的药效物质仍不明确，且良好的传统用药效果和临床应用也亟需建立相应的质量评价方法。作为2015年版《中国药典》——豆豉姜的质量标准增订项目的一部分，本研究对豆豉姜生物碱进行了分离鉴定，并对所获得的单体化合物进行了体外抗炎活性研究，以期为阐明豆豉姜的药效物质和建立科学的质量评价方法提供依据。
1 材料
1.1 药材 豆豉姜药材于2012年8月采自广东省肇庆市怀集县，经北京中医药大学中药学院张媛副教授鉴定为樟科植物山鸡椒L. cubeba的根、根茎和茎的混合品，凭证标本(No. LC201210)存放于北京中医药大学中药现代研究中心。
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1.2 细胞 BV-2小胶质细胞系由中国医学科学院细胞中心提供；小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系购自上海细胞所。
1.3 仪器和试剂 Varian Inova-500型核磁共振仪；Waters Xevo G2 Q-TOF型质谱仪；美国鲁道夫Autopol IV型旋光仪；Sephadex LH-20 GE(Heatcare，瑞典)；ODS(40～63 μm)(Merck，德国)；柱色谱硅胶(200～300目)及薄层色谱硅胶板GF254(青岛海洋化工厂产品)；提取和分离中所用化学试剂均为分析纯(北京化工厂)；SANYO MCO-18AIC细胞培养箱；Motic AE2000倒置荧光显微镜；ESCO OptiMair超净工作台；瑞士TECAN M1000型多功能酶标仪；DMEM培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；NO化学法试剂盒(南京建成生物公司)；阳性对照为槲皮素和姜黄素(Sigma，美国)。
2 提取与分离
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干燥豆豉姜药材50 kg，用10倍量95%乙醇(加0.5%盐酸调pH 2.0)提取2次，75%乙醇提取1次，每次2 h。合并提取液减压回收乙醇后得到总浸膏，以氯仿萃取得到氯仿部位(290 g)，水层加NH3·H2O调pH 10，以正丁醇萃取，得到正丁醇部位(980 g)。
正丁醇部位(950 g)经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇(30∶1～0∶1)梯度洗脱，得到18个流分(LB1～18)。LB13经硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯-甲醇-三乙胺(4∶1∶0.01)洗脱，再经Sephadex LH-20(甲醇)纯化，得到化合物1(11 g)。LB10经硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯-甲醇(10∶1)洗脱，得到12个流分(LB10A～L)。LB10E经ODS柱(甲醇-水 40∶60)分离和Sephadex LH-20(甲醇)纯化，得到化合物2(12 g)和化合物3(5 g)。LB10I经ODS柱(甲醇-水 40∶60)分离和Sephadex LH-20(甲醇)纯化，得到化合物4(10.5 g)。LB10H经多次硅胶柱色谱和ODS柱色谱(甲醇-水 50∶50)分离，并经Sephadex LH-20(甲醇)纯化，得到化合5(580 mg)。LB6经硅胶柱色谱分离，氯仿-丙酮-三乙胺(4∶1∶0.015)洗脱，得到4个流分(LB6A～D)；LB6B经Sephadex LH-20(甲醇)纯化，再经ODS(甲醇∶水∶三乙胺1∶1∶0.025)纯化，得到化合物6(3 g)。LB12经硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯-甲醇-二乙胺(8∶1∶0.045)洗脱，得到化合物7(50 mg)。
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3 结构鉴定
化合物1 灰棕色粉末，碘化铋钾反应阳性；[α]25D +71.5(c 0.08，CH3OH)；ESI-MS m/z 314[M+H]+；1 H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ： 6.52(1H，s，H-3)，2.73(1H，m，Ha-4)，2.56(1H，dd，J=14.0，4.0，Hb-4)，3.10(1H，dd，J=14.0，4.0，Ha-5)，2.73(1H，m，Hb-5)，3.51(1H，dd，J=14.0，4.5，H-6a)，2.44(2H，m，H-7)，6.70(1H，s，H-8)，7.87(1H，s，H-11)，3.58(3H，s，1-OCH3)，3.77(3H，s，10-OCH3)；13C-NMR数据见表1。以上数据与文献[4]对照一致，鉴定为(+)-去甲波尔定，见图1。, 百拇医药(张水英 郭强 曹愿 张媛 高小力 屠鹏飞 柴兴云)