疏肝健脾方药含药血清对LPS刺激下大鼠肝细胞炎症损伤及TLR4/p38MAPK信号通路影响的研究(1)
[摘要] 目的：研究疏肝健脾方药含药血清对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激下大鼠肝细胞炎症反应及TLR4(Toll样受体-4)/p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)信号通路的影响。方法：体外培养并鉴定SD大鼠肝细胞，制备疏肝健脾方药含药血清，对肝细胞进行疏肝健脾方药、p38MAPK抑制剂等药物干预，酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液中白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的表达，Western blot检测 TLR4，p38MAPK，p-p38MAPK蛋白的表达。结果：可提取大鼠疏肝健脾方药含药或空白血清约2～3 mL，大鼠获得纯化后肝细胞1.5×108～2.0×108个，Typan blue染色测定细胞活力均在95%以上，免疫荧光法鉴定确定提取的为肝细胞。肝细胞培养上清的检测：LPS组较空白血清组IL-6，TNF-α水平均有显著升高(P<0.01)。与LPS组比较，药物干预组IL-6，TNF-α表达水平呈显著降低(P<0.01)。肝细胞的蛋白检测：与空白血清组比较，LPS组的p38MAPK，p-p38MAPK，TLR4蛋白表达均有显著升高(P<0.01)；与LPS组比较，SB239063能显著下调p38MAPK的蛋白表达水平(P<0.01)，疏肝健脾组亦有下调，但无显著差异；疏肝健脾组，SB239063组的p-p38MAPK的蛋白表达水平均下调显著(P<0.01)；TLR4蛋白表达水平以疏肝健脾组下调具有显著性差异(P<0.01)，SB239063组下调无显著统计学差异。结论：疏肝健脾方药可能通过TLR4/p38MAPK信号通路调控大鼠肝细胞炎症损伤，含药血清可能是其重要的作用途径之一。
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[关键词]疏肝健脾方药；肝细胞；炎症损伤；TLR4/p38MAPK信号通路；血清药理学
非酒精性脂肪性肝病(nonalcohalic fatty liver disease，NAFLD)已经成为一个全球公共卫生问题，其在全球的发病率约为5%～25%，中国约为15%[1-2]，而大部分NAFLD患者停留在单纯性脂肪变阶段，呈现一个良性非进行性的临床过程，约有3%～5%患者可进展为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)[3-4]。NASH与最终的纤维化，肝硬化和肝癌等终末期肝病密切相关[5]。因此，NASH被认为在NAFLD的疾病演变进程中的重要阶段。NASH作为一种炎症性疾病，炎症在NASH中扮演了关键性的角色[6]，炎症可以导致胞外基质和纤维化在肝脏中沉积。促炎细胞因子的释放及内质网应激在NASH的发展中起重要的作用，并且这些炎症反应不仅来自肝脏，还来自肠道内毒素和脂肪沉积[7]。而肝细胞就是NASH重要的组织炎症来源之一[6，8] 。本课题组前期体内试验表明：NASH大鼠肝细胞TLR4/p38MAPK信号通路能够上调炎症介质IL-6，TNF-α表达，导致肝组织炎症损伤，肝功能受损。而疏肝健脾方药能够调控TLR4/p38MAPK信号通路，下调炎症介质IL-6，TNF-α表达，减轻肝细胞炎症损伤[9]，但其具体作用途径有待于进一步明确。
, 百拇医药
NASH在体研究日益深入之际，体外研究也广泛开展起来，国外有大量报道成功应用原代细胞培养来阐释NAFLD/NASH发病的分子机制[10]。国内亦有应用革兰阴性菌细胞壁的主要成分LPS与其受体结合后，通过多种途径导致肝细胞炎症损伤用于NASH离体研究[11]。这些为体外试验模型的成功建立，为研究NASH肝细胞损伤机制体外试验奠定了良好的基础。本次研究在建立LPS刺激下大鼠肝细胞炎症损伤细胞模型基础上，针对中药复方成分复杂多样的特点，运用可信度、科学性、可行性都较以往应用中药粗制剂直接体外给药更高的血清药理学方法[12]。观察疏肝健脾含药血清通过TLR4/p38MAPK信号通路对LPS刺激下大鼠肝细胞炎症损伤体外模型的影响的研究，通过结合体外试验及血清药理学2种方法，进一步探讨疏肝健脾方药防治NASH的药物作用途径及机制。
1 材料
1.1 动物 SPF级SD大鼠30只，体重(200±20) g，雌雄各半，暨南大学动物实验管理中心提供，动物许可证号SYXK(粤)2012-0117。
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1.2 药物 疏肝健脾方药为柴胡疏肝散和参苓白术散的合方，柴胡疏肝散药物：柴胡6 g，白芍5 g，枳壳5 g，川芎5 g，陈皮6 g，香附5 g，炙甘草3 g。参苓白术散药物：人参15 g，茯苓15 g，白术15 g，白扁豆12 g，莲子9 g，山药15 g，砂仁6 g，薏苡仁9 g，桔梗6 g，炙甘草9 g。以上药物均为深圳华润三九医药股份有限公司提供的中药配方颗粒剂，购自暨南大学附属第一医院中药房，方剂组成和药物剂量均参考《方剂学》[13]。
1.3 试剂与仪器 IV型胶原酶(美国Gbico公司)；胎牛血清(德国Hyclone公司)；Rabbit polyclonal to CK18，Rabbit polyclonal to ED1，Goat anti-Rabbit IgG(H+L)，FITC conjugated(镇江厚普生物科技有限公司)；LPS，SB239063(美国Sigma公司)；IL-6，TNF-α ELISA试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)；Anti-p38MAPK，Anti-phospho-p38MAPK(美国CST公司)；Anti-TLR4(英国Abcam公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；酶联免疫检测仪(美国Thermo Scientific公司)；Mini-sub CELLgT电泳仪、凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。, 百拇医药(龚享文 杨钦河 闫海震 张玉佩 梁荫基 刘益臻 张金文 林春梅 李媛媛)
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[关键词]疏肝健脾方药；肝细胞；炎症损伤；TLR4/p38MAPK信号通路；血清药理学
非酒精性脂肪性肝病(nonalcohalic fatty liver disease，NAFLD)已经成为一个全球公共卫生问题，其在全球的发病率约为5%～25%，中国约为15%[1-2]，而大部分NAFLD患者停留在单纯性脂肪变阶段，呈现一个良性非进行性的临床过程，约有3%～5%患者可进展为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)[3-4]。NASH与最终的纤维化，肝硬化和肝癌等终末期肝病密切相关[5]。因此，NASH被认为在NAFLD的疾病演变进程中的重要阶段。NASH作为一种炎症性疾病，炎症在NASH中扮演了关键性的角色[6]，炎症可以导致胞外基质和纤维化在肝脏中沉积。促炎细胞因子的释放及内质网应激在NASH的发展中起重要的作用，并且这些炎症反应不仅来自肝脏，还来自肠道内毒素和脂肪沉积[7]。而肝细胞就是NASH重要的组织炎症来源之一[6，8] 。本课题组前期体内试验表明：NASH大鼠肝细胞TLR4/p38MAPK信号通路能够上调炎症介质IL-6，TNF-α表达，导致肝组织炎症损伤，肝功能受损。而疏肝健脾方药能够调控TLR4/p38MAPK信号通路，下调炎症介质IL-6，TNF-α表达，减轻肝细胞炎症损伤[9]，但其具体作用途径有待于进一步明确。
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NASH在体研究日益深入之际，体外研究也广泛开展起来，国外有大量报道成功应用原代细胞培养来阐释NAFLD/NASH发病的分子机制[10]。国内亦有应用革兰阴性菌细胞壁的主要成分LPS与其受体结合后，通过多种途径导致肝细胞炎症损伤用于NASH离体研究[11]。这些为体外试验模型的成功建立，为研究NASH肝细胞损伤机制体外试验奠定了良好的基础。本次研究在建立LPS刺激下大鼠肝细胞炎症损伤细胞模型基础上，针对中药复方成分复杂多样的特点，运用可信度、科学性、可行性都较以往应用中药粗制剂直接体外给药更高的血清药理学方法[12]。观察疏肝健脾含药血清通过TLR4/p38MAPK信号通路对LPS刺激下大鼠肝细胞炎症损伤体外模型的影响的研究，通过结合体外试验及血清药理学2种方法，进一步探讨疏肝健脾方药防治NASH的药物作用途径及机制。
1 材料
1.1 动物 SPF级SD大鼠30只，体重(200±20) g，雌雄各半，暨南大学动物实验管理中心提供，动物许可证号SYXK(粤)2012-0117。
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1.2 药物 疏肝健脾方药为柴胡疏肝散和参苓白术散的合方，柴胡疏肝散药物：柴胡6 g，白芍5 g，枳壳5 g，川芎5 g，陈皮6 g，香附5 g，炙甘草3 g。参苓白术散药物：人参15 g，茯苓15 g，白术15 g，白扁豆12 g，莲子9 g，山药15 g，砂仁6 g，薏苡仁9 g，桔梗6 g，炙甘草9 g。以上药物均为深圳华润三九医药股份有限公司提供的中药配方颗粒剂，购自暨南大学附属第一医院中药房，方剂组成和药物剂量均参考《方剂学》[13]。
1.3 试剂与仪器 IV型胶原酶(美国Gbico公司)；胎牛血清(德国Hyclone公司)；Rabbit polyclonal to CK18，Rabbit polyclonal to ED1，Goat anti-Rabbit IgG(H+L)，FITC conjugated(镇江厚普生物科技有限公司)；LPS，SB239063(美国Sigma公司)；IL-6，TNF-α ELISA试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)；Anti-p38MAPK，Anti-phospho-p38MAPK(美国CST公司)；Anti-TLR4(英国Abcam公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；酶联免疫检测仪(美国Thermo Scientific公司)；Mini-sub CELLgT电泳仪、凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。, 百拇医药(龚享文 杨钦河 闫海震 张玉佩 梁荫基 刘益臻 张金文 林春梅 李媛媛)