利用酵母模型研究化合物对青蒿素作用的影响(1)
[摘要]青蒿素类药物在疟疾治疗过程中有着非常重要的作用，且应用多年来尚鲜有真正临床抗药性的病例报道。世界卫生组织推行青蒿素联合疗法，旨在增强青蒿素的药效以及防止耐药病原株的出现。课题借助酵母这一经典模式生物，基于目前已知的青蒿素作用机制和相关理论假说，挑选部分化合物探究其与青蒿素的相互作用，旨在发现能调节青蒿素药效的化合物，并为青蒿素作用机制的研究及临床用药提供参考。实验涉及了氧化剂，抗氧化剂，金属离子，金属螯合剂，解偶联剂等，即将酿酒酵母菌株BY4742在同时含4 μmol·L-1青蒿素与一定浓度化合物的非发酵固体培养基YPGE中30 ℃培养48 h，通过观察其生长状态来评价化合物对青蒿素药效的影响。研究结果表明0.2 mmol·L-1FeCl3，60 μmol·L-1BPS，1 mmol·L-1CuCl2，0.75 mmol·L-1VE和1 mmol·L-1VC对青蒿素有拮抗作用，40 μmol·L-1DNP，0.1 μmol·L-1CCCP和0.25 mmol·L-1H2O2与青蒿素之间存在协同作用。这些结果进一步支持了本实验室先前提出的青蒿素线粒体作用模型，提示改变细胞内氧化还原水平或者导致线粒体功能障碍的化合物会影响青蒿素药效的发挥，该研究同时也为青蒿素联合用药提供了一种简便的筛选方法。
, 百拇医药
[关键词]青蒿素；铁；解偶联剂；线粒体；酵母
青蒿素作为一线抗疟药物，其抗疟疾机制一直没有得到彻底解决。目前关于青蒿素类药物的作用机制包括血红素假说，蛋白靶点假说和线粒体假说等。各方研究显示[1-2]，青蒿素类药物作用机制与线粒体损伤、呼吸链活性、自由基产生和细胞内铁含量等因素有关。
近年来，疟原虫耐药性非常严重，青蒿素为主的联合疗法在临床上被广泛应用，以减少非青蒿素类药物的用药浓度，延缓耐药性的产生，同时具有更好的治疗效果。鉴于疟原虫较难操作，有些技术手段尚不成熟的事实，实验室前期[3-4]借助酵母这一经典模式生物，发现青蒿素在非发酵型YPGE培养基上抑制酵母作用机制与抑制疟原虫作用机制相似，并提出了线粒体假说。本研究便是在这一机制假说的基础上展开的。
本研究挑选了几类化合物，包括氧化剂、抗氧化剂、金属离子、金属螯合剂、解偶联剂等，并探究其与青蒿素的相互作用，旨在发现能调节青蒿素药效的化合物，为青蒿素作用机制研究，联合用药及用药的筛选方法提供参考。
, 百拇医药
1 材料
FeCl3(氯化铁)、CuCl2(氯化铜)、BCS(浴酮灵二磺酸二钠盐)、BPS(磺化浴铜灵)、DNP(2，4-二硝基苯酚)、CCCP(羰基氰化物间氯苯腙)、H2O2(双氧水)、VE(维生素E)、VC(维生素C)均为购自Sigma公司，薄层硅胶板(0.20～0.25 mm G板)由青岛海洋化工厂生产，其他常用化学试剂购自北京化工厂。金属铁离子化合物和螯合剂分别选用FeCl3和BPS，金属铜离子化合物和螯合剂分别选用CuCl2和BCS；解偶联剂选用DNP和CCCP；氧化剂选用H2O2；抗氧化剂选用维生素E和维生素C。
4742酿酒酵母菌株为本实验室提供，青蒿素(artemisinin，ART)购自成都欧康植化科技有限公司。YPGE培养基配方：1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%甘油和2%乙醇，固体培养基的琼脂粉浓度为2%。
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2 方法
2.1 青蒿素与化合物相互作用的测定 具体步骤为在60 ℃左右完全融化的YPGE培养基中加入化合物制成固体培养平板，并使药物终浓度按实验要求依次稀释。将培养至对数生长期的4742酵母菌株用无菌水按10倍梯度稀释，吸取一定量菌悬液滴在含药物的YPGE固体培养基上，30 ℃酵母培养箱放置48 h后观察。本实验分为2个部分：单纯化合物实验组用于测定化合物本身对酵母抑制作用，无需添加青蒿素，选用YPGE作为对照组；化合物与青蒿素相互作用实验组是在前者基础上加入4 μmol·L-1青蒿素，选用4 μmol·L-1青蒿素作为对照组。
2.2 TLC(薄层色谱)鉴定 共有7个实验组，分别是青蒿素、青蒿素+VC、青蒿素+VE、青蒿素+VC+FeCl3、青蒿素+VE+FeCl3、青蒿素+FeCl3、青蒿素+CuCl2，每个实验组反应体系均为500 μL。各实验组中所涉及化合物终浓度分别为青蒿素75 μmol·L-1，VC 10 mmol·L-1，VE 10 mmol·L-1，FeCl3 0.9 mmol·L-1，CuCl2 2 mmol·L-1。30 ℃条件下，把样品固定在旋转混合器上匀速摇动24 h，之后用薄层硅胶板进行展开及显色观察。展开剂石油醚-乙酸乙酯4∶1，硫酸芳草醛作为显色剂。
2.3 呼吸活性测定 将过夜培养的酵母菌株分别转入含FeCl3，CuCl2，BPS，BCS的YPGE培养基，FeCl3，CuCl2，BPS，BCS终浓度依次为1 mmol·L-1，5 mmol·L-1，100 μmol·L-1，10 μmol·L-1，以YPGE为对照组，并使菌液初始A在0.05左右。过夜培养后，用耗氧仪测量各样品呼吸。各菌样品测量时将A调整为一致，实验重复3次。, 百拇医药(龙贡波 孙辰 李坚 曹玉 周兵)
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[关键词]青蒿素；铁；解偶联剂；线粒体；酵母
青蒿素作为一线抗疟药物，其抗疟疾机制一直没有得到彻底解决。目前关于青蒿素类药物的作用机制包括血红素假说，蛋白靶点假说和线粒体假说等。各方研究显示[1-2]，青蒿素类药物作用机制与线粒体损伤、呼吸链活性、自由基产生和细胞内铁含量等因素有关。
近年来，疟原虫耐药性非常严重，青蒿素为主的联合疗法在临床上被广泛应用，以减少非青蒿素类药物的用药浓度，延缓耐药性的产生，同时具有更好的治疗效果。鉴于疟原虫较难操作，有些技术手段尚不成熟的事实，实验室前期[3-4]借助酵母这一经典模式生物，发现青蒿素在非发酵型YPGE培养基上抑制酵母作用机制与抑制疟原虫作用机制相似，并提出了线粒体假说。本研究便是在这一机制假说的基础上展开的。
本研究挑选了几类化合物，包括氧化剂、抗氧化剂、金属离子、金属螯合剂、解偶联剂等，并探究其与青蒿素的相互作用，旨在发现能调节青蒿素药效的化合物，为青蒿素作用机制研究，联合用药及用药的筛选方法提供参考。
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1 材料
FeCl3(氯化铁)、CuCl2(氯化铜)、BCS(浴酮灵二磺酸二钠盐)、BPS(磺化浴铜灵)、DNP(2，4-二硝基苯酚)、CCCP(羰基氰化物间氯苯腙)、H2O2(双氧水)、VE(维生素E)、VC(维生素C)均为购自Sigma公司，薄层硅胶板(0.20～0.25 mm G板)由青岛海洋化工厂生产，其他常用化学试剂购自北京化工厂。金属铁离子化合物和螯合剂分别选用FeCl3和BPS，金属铜离子化合物和螯合剂分别选用CuCl2和BCS；解偶联剂选用DNP和CCCP；氧化剂选用H2O2；抗氧化剂选用维生素E和维生素C。
4742酿酒酵母菌株为本实验室提供，青蒿素(artemisinin，ART)购自成都欧康植化科技有限公司。YPGE培养基配方：1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%甘油和2%乙醇，固体培养基的琼脂粉浓度为2%。
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2 方法
2.1 青蒿素与化合物相互作用的测定 具体步骤为在60 ℃左右完全融化的YPGE培养基中加入化合物制成固体培养平板，并使药物终浓度按实验要求依次稀释。将培养至对数生长期的4742酵母菌株用无菌水按10倍梯度稀释，吸取一定量菌悬液滴在含药物的YPGE固体培养基上，30 ℃酵母培养箱放置48 h后观察。本实验分为2个部分：单纯化合物实验组用于测定化合物本身对酵母抑制作用，无需添加青蒿素，选用YPGE作为对照组；化合物与青蒿素相互作用实验组是在前者基础上加入4 μmol·L-1青蒿素，选用4 μmol·L-1青蒿素作为对照组。
2.2 TLC(薄层色谱)鉴定 共有7个实验组，分别是青蒿素、青蒿素+VC、青蒿素+VE、青蒿素+VC+FeCl3、青蒿素+VE+FeCl3、青蒿素+FeCl3、青蒿素+CuCl2，每个实验组反应体系均为500 μL。各实验组中所涉及化合物终浓度分别为青蒿素75 μmol·L-1，VC 10 mmol·L-1，VE 10 mmol·L-1，FeCl3 0.9 mmol·L-1，CuCl2 2 mmol·L-1。30 ℃条件下，把样品固定在旋转混合器上匀速摇动24 h，之后用薄层硅胶板进行展开及显色观察。展开剂石油醚-乙酸乙酯4∶1，硫酸芳草醛作为显色剂。
2.3 呼吸活性测定 将过夜培养的酵母菌株分别转入含FeCl3，CuCl2，BPS，BCS的YPGE培养基，FeCl3，CuCl2，BPS，BCS终浓度依次为1 mmol·L-1，5 mmol·L-1，100 μmol·L-1，10 μmol·L-1，以YPGE为对照组，并使菌液初始A在0.05左右。过夜培养后，用耗氧仪测量各样品呼吸。各菌样品测量时将A调整为一致，实验重复3次。, 百拇医药(龙贡波 孙辰 李坚 曹玉 周兵)