大蒜素抑制胰岛素诱发血管平滑肌细胞增殖和迁移实验研究(1)
[摘要] 目的：探讨大蒜素(allicin)抑制胰岛素(insulin)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移及其作用机制。方法：采用组织贴块法培养大鼠的VSMCs，并进行平滑肌α-肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光鉴定，取3～5代细胞进行实验。建立胰岛素刺激的VSMCs模型。实验分5组：对照组、胰岛素组、大蒜素组、ERK抑制剂PD98059组、大蒜素+PD98059组。噻唑蓝(CCK8)比色法检测VSMCs的增殖；细胞计数法检测VSMCs的迁移；免疫印迹实验(Western blotting)测定total ERK，Phospho-ERK(p-ERK)，PCNA蛋白表达的情况。结果：原代培养的VSMCs生长良好，光镜下呈长梭形及“峰与谷”样生长。α-SMA免疫荧光显示培养的细胞具有典型的VSMCs特征。胰岛素能刺激VSMCs的增殖和迁移，且以100 nmol·L-1浓度时效果最明显。大蒜素预处理能显著抑制胰岛素刺激的VSMCs的增殖和迁移，且呈剂量依赖性。PD98059、大蒜素+PD98059预处理亦能显著抑制胰岛素刺激的VSMCs的增殖和迁移。胰岛素可明显促进VSMCs表达p-ERK，PCNA蛋白。大蒜素能显著抑制VSMCs表达p-ERK，PCNA蛋白，且呈剂量依赖性。结论：大蒜素能显著抑制胰岛素诱导的VSMCs的增殖与迁移，其作用机制可能是抑制ERK信号通路的激活。
, 百拇医药
[关键词]血管平滑肌细胞；胰岛素；大蒜素；增殖；迁移
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)异常增殖与迁移是引起动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)和介入治疗术后再狭窄的关键因素[1-3]。胰岛素促进VSMCs增殖与迁移导致糖尿病性血管病变是近年来研究热点[4-6]。国内外研究提示，大蒜素可抑制VSMCs增殖[7-8]。本实验观察大蒜素对胰岛素刺激VSMCs增殖与迁移的影响及其可能机制，为大蒜素预防心血管疾病提供科学依据。
1 材料
1.1 动物 健康SD雄性大鼠，体重150～180 g，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 试剂 大蒜素(浓度>98%)，购于Santa Cruz Biotechnology；普通胰岛素购于美国Sigma公司；DMEM细胞培养基为美国Hyclone公司产品；胎牛血清(fetal bovin serum，FBS)为杭州四季青生物工程技术研究所产品；ERK抑制剂PD98059购于Cell Signaling Technology；单克隆兔抗鼠α-actin一抗，单克隆抗体兔抗鼠β-actin一抗，兔抗大鼠增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)一抗ERK，p-ERK一抗均购于Bioworld公司，碱性磷酸酶标记的二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
, 百拇医药
2 方法
2.1 大鼠动脉VSMCs原代培养 无菌条件下分离出SD大鼠胸主动脉，放入加有双抗的PBS中清洗。剥去动脉外膜及内膜，取血管的中层组织洗净后剪碎，接种于20%FBS的DMEM培养基，于5%CO2，37 ℃温箱中培养，用0.25%的胰酶传代。光镜下观察呈“峰-谷”状表现，经α-SMA抗体免疫荧光鉴定后证实为VSMCs，3～5代细胞用于实验。
2.2 分组 实验分为对照组、胰岛素组(1，10，100，1 000 nmol·L-1)、大蒜素组(2.5，5，10 mg·L-1)、PD98059组(20 μmol·L-1)、大蒜素(10 mg·L-1)+PD98059组。
2.3 CCK8法检测细胞增殖 取对数生长期的VSMCs以每孔1×104个种于96孔板中，待细胞生长至80%的融合时，换用不含血清的DMEM培养基培养24 h，使细胞同步于G0期，然后换含10%FBS的DMEM继续培养。分组处理细胞，培养12 h后每孔加入CCK8 10 μL孵育4 h，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。实验重复3次，每次设3～5个复孔，结果取均值。
, 百拇医药
2.4 Transwell法检测细胞迁移 取对数生长期的VSMCs以每孔1×104接种于小室，分组处理细胞，胰岛素100 nmol·L-1组分别培养1.5，3，6，12 h，其余各组均培养12 h后取出小室用4%多聚甲醛固定30 min，苏木紫染色20 min，镜下观察小室外细胞迁移情况。
2.5 蛋白表达的检测 Western blot法测定各组p-ERK活化情况，测定PCNA蛋白表达。用β-actin为内参进行吸光度校正。
2.6 统计学处理 用Graphpad Prism 5.0统计软件进行数据分析，所有数据以±s表示，进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 原代细胞生长的形态及鉴定 倒置显微镜下，培养的VSMCs呈梭形，平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状。免疫细胞化学检测法表明，抗平滑肌肌动蛋白α-SMA抗体呈阳性染色即胞浆内可见大量绿色荧光，证明所培养细胞为VSMCs，见图1。
3.2 CCK8法检测VSMCs的增殖 胰岛素呈浓度依赖性地刺激VSMCs的增殖(P<0.05)，作用的最大效果在本实验内出现在100 nmol·L-1培养12 h，见表1。大蒜素呈浓度依赖性地抑制胰岛素刺激VSMCs的增殖(P<0.05)，作用的最大效果在本实验内出现在10 g·L-1培养12 h，见表2。PD98059，大蒜素(10 mg·L-1)+PD98059能抑制胰岛素刺激VSMCs的增殖(P<0.05)，其作用无统计学差异，见表3。, 百拇医药(李婷 夏勇)
, 百拇医药
[关键词]血管平滑肌细胞；胰岛素；大蒜素；增殖；迁移
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)异常增殖与迁移是引起动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)和介入治疗术后再狭窄的关键因素[1-3]。胰岛素促进VSMCs增殖与迁移导致糖尿病性血管病变是近年来研究热点[4-6]。国内外研究提示，大蒜素可抑制VSMCs增殖[7-8]。本实验观察大蒜素对胰岛素刺激VSMCs增殖与迁移的影响及其可能机制，为大蒜素预防心血管疾病提供科学依据。
1 材料
1.1 动物 健康SD雄性大鼠，体重150～180 g，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.2 试剂 大蒜素(浓度>98%)，购于Santa Cruz Biotechnology；普通胰岛素购于美国Sigma公司；DMEM细胞培养基为美国Hyclone公司产品；胎牛血清(fetal bovin serum，FBS)为杭州四季青生物工程技术研究所产品；ERK抑制剂PD98059购于Cell Signaling Technology；单克隆兔抗鼠α-actin一抗，单克隆抗体兔抗鼠β-actin一抗，兔抗大鼠增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)一抗ERK，p-ERK一抗均购于Bioworld公司，碱性磷酸酶标记的二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
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2 方法
2.1 大鼠动脉VSMCs原代培养 无菌条件下分离出SD大鼠胸主动脉，放入加有双抗的PBS中清洗。剥去动脉外膜及内膜，取血管的中层组织洗净后剪碎，接种于20%FBS的DMEM培养基，于5%CO2，37 ℃温箱中培养，用0.25%的胰酶传代。光镜下观察呈“峰-谷”状表现，经α-SMA抗体免疫荧光鉴定后证实为VSMCs，3～5代细胞用于实验。
2.2 分组 实验分为对照组、胰岛素组(1，10，100，1 000 nmol·L-1)、大蒜素组(2.5，5，10 mg·L-1)、PD98059组(20 μmol·L-1)、大蒜素(10 mg·L-1)+PD98059组。
2.3 CCK8法检测细胞增殖 取对数生长期的VSMCs以每孔1×104个种于96孔板中，待细胞生长至80%的融合时，换用不含血清的DMEM培养基培养24 h，使细胞同步于G0期，然后换含10%FBS的DMEM继续培养。分组处理细胞，培养12 h后每孔加入CCK8 10 μL孵育4 h，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。实验重复3次，每次设3～5个复孔，结果取均值。
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2.4 Transwell法检测细胞迁移 取对数生长期的VSMCs以每孔1×104接种于小室，分组处理细胞，胰岛素100 nmol·L-1组分别培养1.5，3，6，12 h，其余各组均培养12 h后取出小室用4%多聚甲醛固定30 min，苏木紫染色20 min，镜下观察小室外细胞迁移情况。
2.5 蛋白表达的检测 Western blot法测定各组p-ERK活化情况，测定PCNA蛋白表达。用β-actin为内参进行吸光度校正。
2.6 统计学处理 用Graphpad Prism 5.0统计软件进行数据分析，所有数据以±s表示，进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 原代细胞生长的形态及鉴定 倒置显微镜下，培养的VSMCs呈梭形，平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状。免疫细胞化学检测法表明，抗平滑肌肌动蛋白α-SMA抗体呈阳性染色即胞浆内可见大量绿色荧光，证明所培养细胞为VSMCs，见图1。
3.2 CCK8法检测VSMCs的增殖 胰岛素呈浓度依赖性地刺激VSMCs的增殖(P<0.05)，作用的最大效果在本实验内出现在100 nmol·L-1培养12 h，见表1。大蒜素呈浓度依赖性地抑制胰岛素刺激VSMCs的增殖(P<0.05)，作用的最大效果在本实验内出现在10 g·L-1培养12 h，见表2。PD98059，大蒜素(10 mg·L-1)+PD98059能抑制胰岛素刺激VSMCs的增殖(P<0.05)，其作用无统计学差异，见表3。, 百拇医药(李婷 夏勇)