芪附汤调节ERK1/2信号通路改善UUO阳虚证模型肾间质纤维化的作用和机制(1)
[摘要] 目的：探讨芪附汤改善阳虚证模型鼠肾间质纤维化(RIF)的作用和机制。方法：将大鼠随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、芪附汤组(C组)、依那普利组(D组)。通过腺嘌呤灌胃联合单侧输尿管接扎术(UUO)的方法而建立RIF模型。造模成功后，C，D组大鼠分别经灌胃给予芪附汤水煎液或依那普利悬浊液；其余2组大鼠经灌胃给予蒸馏水，共干预3周。各在药物和蒸馏水干预前和干预后第1，2，3周末，分别称量大鼠体重，并检测24 h尿蛋白排泄量(Upro)、尿β2-微球蛋白(Uβ2-MG)、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(NAG)酶。药物干预第3周末，处死全部大鼠，抽取血液，摘除左肾，称重，并留取相应标本，观察肾脏外观和肾小管/间质形态；检测血清环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)和尿酸(UA)；检测肾组织中上皮型黏钙蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、细胞外调节激酶(ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白相对表达量。结果：芪附汤可以改善模型鼠血清中降低的cAMP和cAMP/cGMP；减少模型鼠升高的Uβ2-MG、尿NAG酶，改善肾间质细胞外基质及其胶原沉积，上调肾组织E-cadherin蛋白表达，下调肾组织α-SMA，TGF-β1，CTGF，p-ERK1/2蛋白表达；但是，对Scr，BUN，UA没有影响。芪附汤改善RIF的作用优于依那普利。结论：芪附汤可以改善模型鼠阳虚证指标以及尿β2-MG、尿NAG酶排泄，它可能是通过上调肾组织E-cadherin蛋白表达，下调肾组织α-SMA，TGF-β1，CTGF以及ERK1/2信号通路中关键信号分子——p-ERK1/2蛋白表达，改善肾小管EMT，从而减轻RIF。
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[关键词] 肾小管/间质纤维化；芪附汤；肾小管上皮细胞间充质转分化；ERK1/2信号通路
研究表明，肾小管上皮细胞间充质转分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是慢性肾脏病患者形成肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)的主要病变途径[1-3]。EMT是指肾小管上皮细胞在多种致病因素的影响下失去黏附性，并丢失标志性蛋白，如上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)而表达间充质细胞的标志性蛋白，如α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，最终，发生细胞表型转分化而成为肌成纤维细胞(myofibroblast，MyoF)。转分化后的细胞在形态和功能上出现一些特征性改变，尤其是会过度合成和分泌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，从而，促进肾间质纤维化的形成和进展[4-5]。单侧输尿管接扎术(unilateral ureteral obstruction，UUO)是国际公认的RIF造模方法，UUO模型鼠与人类RIF病理改变相似[6]。据报道[7-8]，UUO模型鼠具备肾小管EMT的典型特征，如肾小管E-cadherin表达减弱，α-SMA表达增强，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)表达上调，ECM过度产生等，而且，这些病变受到包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)1/2通路在内的多条信号通路的调控[9]。据报道[10-11]，一些中药复方或单味中药可以通过调节EMT而改善RIF。芪附汤(Qifu decoction，QFD)是首载于北宋《魏氏家藏》的古方，由黄芪、附子组成，具有“温助肾阳，益气补虚”的功效(《中医方剂大辞典》)。在临床上，QFD可以改善RIF，延缓肾功能减退。然而，迄今为止，其体内的相关作用和机制不甚清楚。因此，笔者借助腺嘌呤灌胃联合UUO的方法建立RIF模型，观察芪附汤对模型鼠EMT的干预作用，试图阐明其通过调节EMT和ERK1/2信号通路的活性而改善RIF的机制。
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1 材料
11 动物 SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠35只，8周龄，体重180～220 g，由南京大学医学院附属鼓楼医院(以下简称鼓楼医院)动物实验中心代购和饲养，合格证号SCXK(苏)2008-0010，所有大鼠均喂予标准饲料，自由饮水，购回后适应性喂养1周。
12 药物和试剂 芪附汤原液配制：生黄芪，产地内蒙古；炮附片，产地四川；2种生药饮片均购自北京同仁堂大药房，由江苏省中医院中药房代煎，并浓缩为生黄芪原液(05 g·mL-1)、炮附子原液(04 g·mL-1)，依据浓度比例(2∶1)混合，配制成芪附汤原液。腺嘌呤(adenine)购于美国Sigma公司，将1 g腺嘌呤溶解于50 mL淀粉溶液中，配置成2%的悬浊液；马来酸依那普利购于江苏扬子江药业集团股份有限公司，将20 mg依那普利溶解于50 mL蒸馏水中，配置成04 g·L-1的依那普利悬浊液，连同中药原液一起放入4 ℃冰箱贮存、备用；全蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒和蛋白相对分子质量标记物购自凯基公司；蛋白上样缓冲液购自碧云天公司；脱脂奶粉购自伊利公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)显色液购自Milipore公司；小鼠抗大鼠α-SMA单克隆抗体、兔抗大鼠CTGF多克隆抗体、兔抗大鼠上皮型黏钙蛋白多克隆抗体和异硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的山羊抗兔多克隆抗体以及山羊抗小鼠单克隆抗体均购自Abcam公司；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体购自Santa Cruze公司，兔抗大鼠ERK1/2和磷酸化-ERK1/2(phosphorylated-ERK 1/2，p-ERK 1/2)多克隆抗体、小鼠抗大鼠甘油醛磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体以及HRP标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG抗体均购自Bioworld生物试剂公司。大鼠血清环磷酸腺苷(serum cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)ELISA试剂盒购自上海优宁维生物制剂公司。其中，部分试剂和抗体委托鼓楼医院科研部代购。, 百拇医药(孙伟 尹雪皎 涂玥 万毅刚 刘红 胡浩)
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[关键词] 肾小管/间质纤维化；芪附汤；肾小管上皮细胞间充质转分化；ERK1/2信号通路
研究表明，肾小管上皮细胞间充质转分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是慢性肾脏病患者形成肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)的主要病变途径[1-3]。EMT是指肾小管上皮细胞在多种致病因素的影响下失去黏附性，并丢失标志性蛋白，如上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)而表达间充质细胞的标志性蛋白，如α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，最终，发生细胞表型转分化而成为肌成纤维细胞(myofibroblast，MyoF)。转分化后的细胞在形态和功能上出现一些特征性改变，尤其是会过度合成和分泌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，从而，促进肾间质纤维化的形成和进展[4-5]。单侧输尿管接扎术(unilateral ureteral obstruction，UUO)是国际公认的RIF造模方法，UUO模型鼠与人类RIF病理改变相似[6]。据报道[7-8]，UUO模型鼠具备肾小管EMT的典型特征，如肾小管E-cadherin表达减弱，α-SMA表达增强，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)表达上调，ECM过度产生等，而且，这些病变受到包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)1/2通路在内的多条信号通路的调控[9]。据报道[10-11]，一些中药复方或单味中药可以通过调节EMT而改善RIF。芪附汤(Qifu decoction，QFD)是首载于北宋《魏氏家藏》的古方，由黄芪、附子组成，具有“温助肾阳，益气补虚”的功效(《中医方剂大辞典》)。在临床上，QFD可以改善RIF，延缓肾功能减退。然而，迄今为止，其体内的相关作用和机制不甚清楚。因此，笔者借助腺嘌呤灌胃联合UUO的方法建立RIF模型，观察芪附汤对模型鼠EMT的干预作用，试图阐明其通过调节EMT和ERK1/2信号通路的活性而改善RIF的机制。
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1 材料
11 动物 SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠35只，8周龄，体重180～220 g，由南京大学医学院附属鼓楼医院(以下简称鼓楼医院)动物实验中心代购和饲养，合格证号SCXK(苏)2008-0010，所有大鼠均喂予标准饲料，自由饮水，购回后适应性喂养1周。
12 药物和试剂 芪附汤原液配制：生黄芪，产地内蒙古；炮附片，产地四川；2种生药饮片均购自北京同仁堂大药房，由江苏省中医院中药房代煎，并浓缩为生黄芪原液(05 g·mL-1)、炮附子原液(04 g·mL-1)，依据浓度比例(2∶1)混合，配制成芪附汤原液。腺嘌呤(adenine)购于美国Sigma公司，将1 g腺嘌呤溶解于50 mL淀粉溶液中，配置成2%的悬浊液；马来酸依那普利购于江苏扬子江药业集团股份有限公司，将20 mg依那普利溶解于50 mL蒸馏水中，配置成04 g·L-1的依那普利悬浊液，连同中药原液一起放入4 ℃冰箱贮存、备用；全蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒和蛋白相对分子质量标记物购自凯基公司；蛋白上样缓冲液购自碧云天公司；脱脂奶粉购自伊利公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)显色液购自Milipore公司；小鼠抗大鼠α-SMA单克隆抗体、兔抗大鼠CTGF多克隆抗体、兔抗大鼠上皮型黏钙蛋白多克隆抗体和异硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的山羊抗兔多克隆抗体以及山羊抗小鼠单克隆抗体均购自Abcam公司；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体购自Santa Cruze公司，兔抗大鼠ERK1/2和磷酸化-ERK1/2(phosphorylated-ERK 1/2，p-ERK 1/2)多克隆抗体、小鼠抗大鼠甘油醛磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体以及HRP标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG抗体均购自Bioworld生物试剂公司。大鼠血清环磷酸腺苷(serum cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)ELISA试剂盒购自上海优宁维生物制剂公司。其中，部分试剂和抗体委托鼓楼医院科研部代购。, 百拇医药(孙伟 尹雪皎 涂玥 万毅刚 刘红 胡浩)