茯苓不同药用部位中三萜酸类成分HPLC指纹图谱研究(1)
[摘要] 目的：建立并比较茯苓不同药用部位中三萜酸类成分的HPLC特征指纹图谱，为完善茯苓的质量控制方法提供依据。方法：采用HPLC测定，Waters Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱；检测波长210 nm；体积流量1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；采用SPSS 15.0进行聚类分析。结果：建立了茯苓不同药用部位中三萜酸类成分的指纹图谱；22批茯苓药材指纹图谱中标示出16个共有峰，方法学考察结果符合指纹图谱技术要求；相似度和聚类分析结果表明，白茯苓、茯神与赤茯苓中三萜酸成分存在显著差异，赤茯苓中茯苓酸的含量最高。药材的质量产地间无显著差异。结论：该方法稳定可靠，重复性好，所建立的指纹图谱能有效的评价茯苓药材的质量。
[关键词] 茯苓；HPLC指纹图谱；聚类分析；相似度
茯苓为多孔菌科真菌Poria cocos (Schw. ) Wolf的干燥菌核，其味甘、淡，性平，归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿、健脾、宁心之功效[1]，其化学成分主要有茯苓多糖、茯苓三萜(茯苓酸、土莫酸等) 、树胶、蛋白质和脂肪酸等[2-6]。茯苓始载于《神农本草经》，是著名中成药“桂枝茯苓胶囊”的原材料之一。传统认为茯苓以云南为道地产区， 但发展人工栽培以来， 湖北、安徽等地均也建立了示范产地， 成为茯苓的主产区。为了控制茯苓药材的质量，昝俊峰等对不同产地[7-8]、不同菌种来源[9]的茯苓药材进行了指纹图谱研究，结果表明，产地对茯苓药材的质量具有重要的影响；张琦等[10-12]对不同药用部位的茯苓药材进行了UPLC指纹图谱研究，并对药材中的三萜成分进行了定性分析。但是现有文献报道中的药材或药用部位仅限于茯苓皮、茯苓片与茯苓块，尚无HPLC指纹图谱用于鉴定白茯苓、茯神及赤茯苓3个不同药用部位的相关报道。为了探讨该3个药用部位及产地是否存在显著的化学成分差异，本实验首次对收集到的22批不同产地的白茯苓、茯神、赤茯苓药材中的三萜酸类成分进行了HPLC指纹图谱表征和比较，通过对样品HPLC图谱数据进行相似度评价、聚类分析和主成分分析，为全面评价茯苓药材质量提供了依据。
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1 材料
Agilent 1200型高效液相色谱仪(包含两元泵、柱温箱、在线脱气机、自动进样器、MWD 检测器)；BP211D 型电子分析天平(德国Sartorius 公司)；Centrifuge 5415D 高速离心机(德国Eppendorf 公司)；Milli-Q Academic 纯水机(法国Millipore)；KQ-250DB 型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。
茯苓酸对照品为自制，经质谱鉴定，采用峰面积归一化法计算，纯度大于99%；乙腈、三氟乙酸为色谱纯，水为纯化水，甲醇、磷酸、甲酸为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试溶液的制备
取药材粉末5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，浸泡30 min，然后超声处理60 min(功率250 W，频率40 KHz)，放冷，滤过，取续液滤25 mL，蒸干(不高于70 ℃)，残渣用甲醇溶解，定容至5 mL，离心，即得供试样品。
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2.2 色谱条件
Waters Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；流动相0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～30 min，50%～55% B；30～40 min，55%～60% B；40～50 min，60%～65% B；50～60min，65%～70% B；60～70 min，70%～75% B；70～80 min，75%～85% B；80～85 min，85%～90% B；85～90 min，90% B。检测波长210 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL·min-1；理论塔板数以茯苓酸峰计算不低于4 000。
2.3 茯苓药材
茯苓药材样品见表1，经吴舟执业药师鉴定为多孔菌科真菌茯苓P. cocos，密封保存于阴凉干燥处。
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2.4 方法学考察
2.4.1 稳定性试验 取大别山1白茯苓样品，按2.1项下方法制备，依据2.2项下色谱条件在0，2，4，8，12，18，24，28 h分别进样测定，记录色谱图，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.030%～0.43%和0.35%～4.4%，表明供试品溶液在28 h内稳定。
2.4.2 精密度试验 取大别山1白茯苓样品，按2.1项下方法制备，依据2.2项下色谱条件，连续进样6次，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.030%～0.46%和0.35%～2.1%，表明仪器等整个系统的精密度良好。
2.4.3 重复性试验 取大别山1白茯苓样品，按2.1项下方法制备，平行制备6份，依据2.2项下色谱条件，分别进样测定，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.020%～0.33%和0.42%～3.87%，表明该分析方法重复性良好。
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2.4.4 溶剂峰与滞后峰的考察 测试结果表明溶剂无干扰，延长至2倍保留时间，未见有滞后峰。
2.5 茯苓三萜酸类高效液相色谱指纹图谱的建立
2.5.1 HPLC指纹图谱的建立 精密吸取供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，依据2.2项下色谱条件，记录色谱峰。
2.5.2 不同药用部位不同产地茯苓的指纹图谱比较 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版，国家药典委员会)建立对照指纹图谱。白茯苓药材的对照指纹图谱见图1，茯神药材的对照指纹图谱见图2，赤茯苓指纹图谱见图3。其中共有的典型色谱峰共16个，分别出现在20.609，22.209，23.595，25.500，28.096，31.224，32.033，37.859，41.420，55.007，57.402，60.848，64.605，75.843，77.021，79.245 min。共有峰面积占总峰面积的百分比均在90以上。通过与对照品对比，13号峰为茯苓酸，将其作为参照峰(S)，分别求出各峰与其相对保留时间和峰面积比值，结果见表2，3。, 百拇医药(李红娟 李家春 胡军华 刘威 毕宇安 王振中 萧伟)
[关键词] 茯苓；HPLC指纹图谱；聚类分析；相似度
茯苓为多孔菌科真菌Poria cocos (Schw. ) Wolf的干燥菌核，其味甘、淡，性平，归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿、健脾、宁心之功效[1]，其化学成分主要有茯苓多糖、茯苓三萜(茯苓酸、土莫酸等) 、树胶、蛋白质和脂肪酸等[2-6]。茯苓始载于《神农本草经》，是著名中成药“桂枝茯苓胶囊”的原材料之一。传统认为茯苓以云南为道地产区， 但发展人工栽培以来， 湖北、安徽等地均也建立了示范产地， 成为茯苓的主产区。为了控制茯苓药材的质量，昝俊峰等对不同产地[7-8]、不同菌种来源[9]的茯苓药材进行了指纹图谱研究，结果表明，产地对茯苓药材的质量具有重要的影响；张琦等[10-12]对不同药用部位的茯苓药材进行了UPLC指纹图谱研究，并对药材中的三萜成分进行了定性分析。但是现有文献报道中的药材或药用部位仅限于茯苓皮、茯苓片与茯苓块，尚无HPLC指纹图谱用于鉴定白茯苓、茯神及赤茯苓3个不同药用部位的相关报道。为了探讨该3个药用部位及产地是否存在显著的化学成分差异，本实验首次对收集到的22批不同产地的白茯苓、茯神、赤茯苓药材中的三萜酸类成分进行了HPLC指纹图谱表征和比较，通过对样品HPLC图谱数据进行相似度评价、聚类分析和主成分分析，为全面评价茯苓药材质量提供了依据。
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1 材料
Agilent 1200型高效液相色谱仪(包含两元泵、柱温箱、在线脱气机、自动进样器、MWD 检测器)；BP211D 型电子分析天平(德国Sartorius 公司)；Centrifuge 5415D 高速离心机(德国Eppendorf 公司)；Milli-Q Academic 纯水机(法国Millipore)；KQ-250DB 型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。
茯苓酸对照品为自制，经质谱鉴定，采用峰面积归一化法计算，纯度大于99%；乙腈、三氟乙酸为色谱纯，水为纯化水，甲醇、磷酸、甲酸为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试溶液的制备
取药材粉末5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，浸泡30 min，然后超声处理60 min(功率250 W，频率40 KHz)，放冷，滤过，取续液滤25 mL，蒸干(不高于70 ℃)，残渣用甲醇溶解，定容至5 mL，离心，即得供试样品。
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2.2 色谱条件
Waters Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；流动相0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～30 min，50%～55% B；30～40 min，55%～60% B；40～50 min，60%～65% B；50～60min，65%～70% B；60～70 min，70%～75% B；70～80 min，75%～85% B；80～85 min，85%～90% B；85～90 min，90% B。检测波长210 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL·min-1；理论塔板数以茯苓酸峰计算不低于4 000。
2.3 茯苓药材
茯苓药材样品见表1，经吴舟执业药师鉴定为多孔菌科真菌茯苓P. cocos，密封保存于阴凉干燥处。
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2.4 方法学考察
2.4.1 稳定性试验 取大别山1白茯苓样品，按2.1项下方法制备，依据2.2项下色谱条件在0，2，4，8，12，18，24，28 h分别进样测定，记录色谱图，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.030%～0.43%和0.35%～4.4%，表明供试品溶液在28 h内稳定。
2.4.2 精密度试验 取大别山1白茯苓样品，按2.1项下方法制备，依据2.2项下色谱条件，连续进样6次，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.030%～0.46%和0.35%～2.1%，表明仪器等整个系统的精密度良好。
2.4.3 重复性试验 取大别山1白茯苓样品，按2.1项下方法制备，平行制备6份，依据2.2项下色谱条件，分别进样测定，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.020%～0.33%和0.42%～3.87%，表明该分析方法重复性良好。
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2.4.4 溶剂峰与滞后峰的考察 测试结果表明溶剂无干扰，延长至2倍保留时间，未见有滞后峰。
2.5 茯苓三萜酸类高效液相色谱指纹图谱的建立
2.5.1 HPLC指纹图谱的建立 精密吸取供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，依据2.2项下色谱条件，记录色谱峰。
2.5.2 不同药用部位不同产地茯苓的指纹图谱比较 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版，国家药典委员会)建立对照指纹图谱。白茯苓药材的对照指纹图谱见图1，茯神药材的对照指纹图谱见图2，赤茯苓指纹图谱见图3。其中共有的典型色谱峰共16个，分别出现在20.609，22.209，23.595，25.500，28.096，31.224，32.033，37.859，41.420，55.007，57.402，60.848，64.605，75.843，77.021，79.245 min。共有峰面积占总峰面积的百分比均在90以上。通过与对照品对比，13号峰为茯苓酸，将其作为参照峰(S)，分别求出各峰与其相对保留时间和峰面积比值，结果见表2，3。, 百拇医药(李红娟 李家春 胡军华 刘威 毕宇安 王振中 萧伟)