丹参类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)基因全长克隆及其生物信息学分析(1)
[摘要] 根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物，采用RACE方法克隆类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)全长cDNA，并进行生物信息学分析；采用实时定量PCR检测茉莉酸甲酯(MeJA)诱导丹参毛状根不同时期的SmKOL表达水平。克隆得到的SmKOL全长cDNA由1 884个核苷酸组成，具有完整编码框，编码519个氨基酸，蛋白相对分子质量约为58.88 kDa，等电点pI 7.62；实时定量PCR结果表明该基因受MeJA诱导后，表达水平在36 h时达到最大值。从丹参毛状根中克隆得到1条SmKOL全长cDNA，为进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制提供了靶基因。
[关键词] 丹参；类贝壳杉烯氧化酶；cDNA末端快速扩增；生物信息学分析
中药丹参是唇形科鼠尾草属类植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，具有活血通经、祛瘀止痛、清心除烦、凉血消痈等作用。赤霉素(gibberellins， GAs)属于一类四环双萜类植物激素，它对植物的种子萌发、细胞伸长与分裂、开花及果实发育等主要的生长发育过程具有调控作用[1]。研究表明，GA生物合成中需要多种酶的参与[2]，如柯巴焦磷酸合酶(ent-copalyl pyrophosphatesynthase， CPS)、贝壳杉烯合酶(ent-kaurene synthase， KS )、贝壳杉烯C19氧化酶(ent-kaurene oxidase，EKO)、贝壳杉烯酸C7β羟化酶、GA-C12-醛合成酶、GA-C7-氧化酶、GA-C13-羟化酶、GA-C20-氧化酶、GA-C3β-羟化酶和GA-C2-氧化酶所有高等植物都含有类贝壳杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase， KO)，它属于细胞色素P450(CYP)701家族，参与赤霉素生物合成[3]。贝壳杉烯氧化酶是催化贝壳杉烯生成贝壳杉烯酸的关键酶。迄今为止，KO基因已从梨[4]、小立碗藓[5]、苦瓜[6]、大米[7]、玉米[8]、拟南芥[9]等中克隆得到。
, http://www.100md.com
本研究通过cDNA快速末端扩增(RACE)技术，从丹参中克隆得到了1个1 884 bp核苷酸的类贝壳杉烯氧化酶(Salvia miltiorrhiza ent-kaurene oxidase like， SmKOL)全长cDNA序列，该序列具有完整的开放阅读框(ORF)，基因编码区编码519个氨基酸的蛋白。此外，本文用茉莉酸甲酯(MeJA)诱导丹参毛状根，研究了不同时间点MeJA诱导下，SmKOL基因的表达情况，有助于进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制。
1 材料
丹参毛状根由发根农杆菌ACCC10060(中科院植物所信号中心漆小泉研究员惠赠)侵染丹参苗(陕西商洛)获得。
9700PCR扩增仪(ABI)，7300荧光定量PCR仪(ABI)，HC-3618R冷冻高速离心机(Eppendorf)，凝胶成像系统(YC971)等；Trizol试剂盒(invitrogen)，SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，Primescript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒(Takara)，Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)，Taq酶(Takara)，pMD19-T载体。
, 百拇医药
2 方法
2.1 丹参毛状根的悬浮培养及诱导处理 无菌条件下将2.0 g丹参毛状根接种于装有50 mL 6，7-V液体培养基的100 mL三角瓶中。于25 ℃，110～120 r·min-1，黑暗条件下进行悬浮培养，18 d后作为实验材料。在6，7-V液体培养基中加入200 mmol·L-1的MeJA(终浓度为200 μmol·L-1)进行诱导处理，在设置的不同时间点分批次收获毛状根，用吸水纸吸干，液氮速冻后-70 ℃保存备用。
2.2 SmKOL全长基因的克隆 采用Trizol法提取丹参毛状根总RNA。使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒扩增SmKOL的3′和5′末端。5′-RACE：根据SmKOL的cDNA片段序列设计5′-RACE扩增特异引物，上游引物KOL-5′为5′-CAGTCCCGACGCCGCACTGACTCAGAT-3′，下游引物为试剂盒提供的非特异引物UPM。cDNA模板为5′-RACE第一链cDNA，反应体系50 μL包括2.5 μL cDNA (5′-RACE第一链cDNA)，5 μL UPM (10×)，1 μL的5′-F (10 μmol·L-1)，34.5 μL PCR-grade water，5 μL advantage 2 PCR buffer (10×)，1 μL dNTP mix (10 μmol·L-1)及1 μL advantage 2 polymerase mix (50×)。反应程序为94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min ，5个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min ，25个循环。3′-RACE：上游为非特异引物UPM，下游特异引物KOL-3′为5′-GTCGTGCGGTCTGACGGCGATAGTGA-3′，模板为3′-RACE cDNA第一链cDNA，扩增条件与5′-RACE相同。PCR产物切胶回收后与pMD19-T载体连接，转化至感受态大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行PCR扩增，将阳性克隆送测序，所得序列的3′端和5′端拼接。再从拼接后序列的3′端和5′端分别设计全长引物，以5′-RACE-Ready cDNA为模板，按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作说明书，克隆扩增SmKOL全长。PCR反应体系50 μL包括10 μL PrimerSTAR GXL Buffer(5×)；4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)；全长引物KOL-L：5′-TCAATGGATACACTGCTGAGTC-3′；KOL-R：5′-GAGATTGGAGATGCTCTCGTAC -3′各1 μL；1 μL的模板；1 μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。PCR反应条件为98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，30个循环；68 ℃ 5 min。PCR切胶回收后与pMD19-T载体连接，转化至DH5α中，挑取单克隆进行PCR扩增，将阳性克隆送测序，所得序列即为SmKOL全长cDNA序列。, 百拇医药(胡雅婷 高伟 刘雨佳 程琪庆 苏平 刘玉忠 陈敏)
[关键词] 丹参；类贝壳杉烯氧化酶；cDNA末端快速扩增；生物信息学分析
中药丹参是唇形科鼠尾草属类植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，具有活血通经、祛瘀止痛、清心除烦、凉血消痈等作用。赤霉素(gibberellins， GAs)属于一类四环双萜类植物激素，它对植物的种子萌发、细胞伸长与分裂、开花及果实发育等主要的生长发育过程具有调控作用[1]。研究表明，GA生物合成中需要多种酶的参与[2]，如柯巴焦磷酸合酶(ent-copalyl pyrophosphatesynthase， CPS)、贝壳杉烯合酶(ent-kaurene synthase， KS )、贝壳杉烯C19氧化酶(ent-kaurene oxidase，EKO)、贝壳杉烯酸C7β羟化酶、GA-C12-醛合成酶、GA-C7-氧化酶、GA-C13-羟化酶、GA-C20-氧化酶、GA-C3β-羟化酶和GA-C2-氧化酶所有高等植物都含有类贝壳杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase， KO)，它属于细胞色素P450(CYP)701家族，参与赤霉素生物合成[3]。贝壳杉烯氧化酶是催化贝壳杉烯生成贝壳杉烯酸的关键酶。迄今为止，KO基因已从梨[4]、小立碗藓[5]、苦瓜[6]、大米[7]、玉米[8]、拟南芥[9]等中克隆得到。
, http://www.100md.com
本研究通过cDNA快速末端扩增(RACE)技术，从丹参中克隆得到了1个1 884 bp核苷酸的类贝壳杉烯氧化酶(Salvia miltiorrhiza ent-kaurene oxidase like， SmKOL)全长cDNA序列，该序列具有完整的开放阅读框(ORF)，基因编码区编码519个氨基酸的蛋白。此外，本文用茉莉酸甲酯(MeJA)诱导丹参毛状根，研究了不同时间点MeJA诱导下，SmKOL基因的表达情况，有助于进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制。
1 材料
丹参毛状根由发根农杆菌ACCC10060(中科院植物所信号中心漆小泉研究员惠赠)侵染丹参苗(陕西商洛)获得。
9700PCR扩增仪(ABI)，7300荧光定量PCR仪(ABI)，HC-3618R冷冻高速离心机(Eppendorf)，凝胶成像系统(YC971)等；Trizol试剂盒(invitrogen)，SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，Primescript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒(Takara)，Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)，Taq酶(Takara)，pMD19-T载体。
, 百拇医药
2 方法
2.1 丹参毛状根的悬浮培养及诱导处理 无菌条件下将2.0 g丹参毛状根接种于装有50 mL 6，7-V液体培养基的100 mL三角瓶中。于25 ℃，110～120 r·min-1，黑暗条件下进行悬浮培养，18 d后作为实验材料。在6，7-V液体培养基中加入200 mmol·L-1的MeJA(终浓度为200 μmol·L-1)进行诱导处理，在设置的不同时间点分批次收获毛状根，用吸水纸吸干，液氮速冻后-70 ℃保存备用。
2.2 SmKOL全长基因的克隆 采用Trizol法提取丹参毛状根总RNA。使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒扩增SmKOL的3′和5′末端。5′-RACE：根据SmKOL的cDNA片段序列设计5′-RACE扩增特异引物，上游引物KOL-5′为5′-CAGTCCCGACGCCGCACTGACTCAGAT-3′，下游引物为试剂盒提供的非特异引物UPM。cDNA模板为5′-RACE第一链cDNA，反应体系50 μL包括2.5 μL cDNA (5′-RACE第一链cDNA)，5 μL UPM (10×)，1 μL的5′-F (10 μmol·L-1)，34.5 μL PCR-grade water，5 μL advantage 2 PCR buffer (10×)，1 μL dNTP mix (10 μmol·L-1)及1 μL advantage 2 polymerase mix (50×)。反应程序为94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min ，5个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min ，25个循环。3′-RACE：上游为非特异引物UPM，下游特异引物KOL-3′为5′-GTCGTGCGGTCTGACGGCGATAGTGA-3′，模板为3′-RACE cDNA第一链cDNA，扩增条件与5′-RACE相同。PCR产物切胶回收后与pMD19-T载体连接，转化至感受态大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行PCR扩增，将阳性克隆送测序，所得序列的3′端和5′端拼接。再从拼接后序列的3′端和5′端分别设计全长引物，以5′-RACE-Ready cDNA为模板，按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作说明书，克隆扩增SmKOL全长。PCR反应体系50 μL包括10 μL PrimerSTAR GXL Buffer(5×)；4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)；全长引物KOL-L：5′-TCAATGGATACACTGCTGAGTC-3′；KOL-R：5′-GAGATTGGAGATGCTCTCGTAC -3′各1 μL；1 μL的模板；1 μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。PCR反应条件为98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，30个循环；68 ℃ 5 min。PCR切胶回收后与pMD19-T载体连接，转化至DH5α中，挑取单克隆进行PCR扩增，将阳性克隆送测序，所得序列即为SmKOL全长cDNA序列。, 百拇医药(胡雅婷 高伟 刘雨佳 程琪庆 苏平 刘玉忠 陈敏)