基于ITS2序列鉴别前胡和紫花前胡药材及其混伪品(1)
[摘要] 为应用ITS2序列对前胡、紫花前胡药材及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究，该文依据国家药典委员会公布的《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》，PCR扩增前胡、紫花前胡及其混伪品的ITS2序列并进行双向测序。经CodonCode Aligner V 3.7.1对测序峰图进行校对拼接，采用MEGA5.0软件分析相关数据。结果表明：前胡药材的ITS2序列长度为229～230 bp，种内变异较小，平均K2P遗传距离为0.005。紫花前胡药材的ITS2序列长度为227 bp，种内无变异。前胡、紫花前胡药材与其混伪品的种间平均K2P遗传距离分别为0.044，0.065。紫花前胡的种间最小K2P遗传距离明显大于其种内的最大K2P遗传距离。最小距离法和NJ树鉴定结果表明前胡、紫花前胡均能与其混伪品明显区分。因此，ITS2序列可有效鉴别前胡、紫花前胡药材及其混伪品。
[关键词] 前胡； 紫花前胡；混伪品；ITS2； 鉴别
中药材前胡Peucedani Radix为伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根[1]。具降气化痰，散风清热的作用，用于治疗痰热喘满，咯痰黄稠，风热咳嗽痰多等症[1-3]。中药材紫花前胡Peucedani Decursivi Radix为伞形科植物紫花前胡P. decursivum (Miq.) Maxim.的干燥根[1]。具有疏风清热、下气化痰等功效，主要用于治疗风热头痛、痰热咳喘、呕逆、胸膈满闷等疾病。药理研究表明，紫花前胡挥发油的醇提物具有抑制癌细胞的生长和代谢作用[4]。前胡中一些吡喃类香豆素类具有钙离子拮抗活性，可治疗心血管疾病。近年来前胡和紫花前胡药材备受关注[5]，市场上混伪品也较多，如石防风P. terebinthaceum (Fisch.) Fisch ex Turcz.[6]、防风Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.以及同属的滨海前胡P. japonicum Thunb[5]、泰山前胡P. wawrae (Wolff) Su和华中前胡P. medicum Dunn等作为伪品入药，严重影响了前胡和紫花前胡药材的质量和临床用药安全，对前胡和紫花前胡药材基原的准确鉴定已至关重要。目前尽管已采用性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱等技术对前胡药材及其混伪品进行了鉴别[5-8]。但由于传统鉴定方法的局限性，使前胡药材及其混伪品的准确鉴定相对困难。
, 百拇医药
DNA条形码(DNA barcoding)分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充，该方法有明确的鉴定标准和法定的鉴定指导原则有利于实现物种鉴定的标准化[9-10]。自Chen等[11]首次提出把ITS2作为药用植物鉴定的标准DNA条形码以来，ITS2条形码序列就备受关注[12-14]，已被广泛用于多种药用植物和药材的鉴定，表现出较强的鉴定能力[15-24]。本研究应用ITS2序列对前胡与紫花前胡药材及其同属密切相关种进行鉴定，为前胡和紫花前胡药材的快速准确鉴定提供了新的技术手段。
1 材料
本文所用材料共8个物种37个样品，包括实验样品及GenBank下载序列。
所有材料经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，凭证样本保存于中国医学科学院药用植物研究所。实验材料及GenBank下载序列信息见表1。
, 百拇医药
2 方法
2.1 DNA提取 为避免材料表面的污染，所有实验材料的前处理参照文献进行[25]。取约40 mg经前处理的材料，加入3% 的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，经研磨仪(Retsch MM400， Germany)充分研碎后加入DNA裂解液56 ℃ 水浴过夜，用氯仿-异戊醇(24∶1)抽提2 次，-20 ℃预冷的异丙醇中沉淀DNA，其余步骤按照试剂盒说明进行。
2.2 PCR扩增及测序 ITS2序列的PCR反应体系为25 μL，包括2×Easy Taq PCR SuperMix (TransGen Biotech Co.， China)12.5 μL，2.5 μmol·L-1引物各1 μL、模板DNA约50 ng，ddH2O补足至25 μL。PCR扩增用引物、扩增程序等参考Chen等[11]研究。PCR产物经纯化后，使用ABI 3730XL( Applied Biosystems Co.，USA) 测序仪进行双向测序。
, http://www.100md.com
2.3 数据处理 测序峰图用CondonCode Aligner V3. 7. 1校对拼接，去除低质量序列及引物区，获得 ITS2 序列。所有序列经软件MEGA5.0进行变异位点分析和K2P(Kimura-2-parameter)遗传距离的计算。利用比对法(BLAST1)和最小距离法(Nearest distance)对前胡药材及其混伪品进行鉴定分析。用邻接 (NJ) 法构建系统聚类树， 利用bootstrap(1 000次重复) 检验各分支的支持率。
3 结果
3.1 前胡、紫花前胡药材ITS2序列的种内变异分析 前胡及紫花前胡药材ITS2序列经MEGA5.0分析比对后的片段长度、G+C含量等信息见表1。
不同来源的前胡药材的ITS2序列长度为229～230 bp，分为4个不同的单倍型(表1)，单倍型A1序列全部与KJ680228相同，单倍型A2序列与KJ680226相同，与单倍型A1相比，在208 bp处缺失；KJ680230为单倍型A3，在228 bp处C-T变异； KJ680235为单倍型A4，在54 bp处T-G变异，在82 bp处、190 bp处T-C变异，在146 bp处C-T变异，在155 bp处A-C变异，在163 bp处A-G变异，在182 bp处A缺失。基于K2P模型计算的遗传距离表明，前胡药材ITS2序列的种内K2P遗传距离为0～0.023，平均K2P遗传距离为0.005。不同来源的紫花前胡药材的ITS2序列长度为227 bp，序列种内无变异，同为单倍型B1。, 百拇医药(侯典云 宋经元 杨培 周红 辛天怡 姚辉)
[关键词] 前胡； 紫花前胡；混伪品；ITS2； 鉴别
中药材前胡Peucedani Radix为伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根[1]。具降气化痰，散风清热的作用，用于治疗痰热喘满，咯痰黄稠，风热咳嗽痰多等症[1-3]。中药材紫花前胡Peucedani Decursivi Radix为伞形科植物紫花前胡P. decursivum (Miq.) Maxim.的干燥根[1]。具有疏风清热、下气化痰等功效，主要用于治疗风热头痛、痰热咳喘、呕逆、胸膈满闷等疾病。药理研究表明，紫花前胡挥发油的醇提物具有抑制癌细胞的生长和代谢作用[4]。前胡中一些吡喃类香豆素类具有钙离子拮抗活性，可治疗心血管疾病。近年来前胡和紫花前胡药材备受关注[5]，市场上混伪品也较多，如石防风P. terebinthaceum (Fisch.) Fisch ex Turcz.[6]、防风Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.以及同属的滨海前胡P. japonicum Thunb[5]、泰山前胡P. wawrae (Wolff) Su和华中前胡P. medicum Dunn等作为伪品入药，严重影响了前胡和紫花前胡药材的质量和临床用药安全，对前胡和紫花前胡药材基原的准确鉴定已至关重要。目前尽管已采用性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱等技术对前胡药材及其混伪品进行了鉴别[5-8]。但由于传统鉴定方法的局限性，使前胡药材及其混伪品的准确鉴定相对困难。
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DNA条形码(DNA barcoding)分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充，该方法有明确的鉴定标准和法定的鉴定指导原则有利于实现物种鉴定的标准化[9-10]。自Chen等[11]首次提出把ITS2作为药用植物鉴定的标准DNA条形码以来，ITS2条形码序列就备受关注[12-14]，已被广泛用于多种药用植物和药材的鉴定，表现出较强的鉴定能力[15-24]。本研究应用ITS2序列对前胡与紫花前胡药材及其同属密切相关种进行鉴定，为前胡和紫花前胡药材的快速准确鉴定提供了新的技术手段。
1 材料
本文所用材料共8个物种37个样品，包括实验样品及GenBank下载序列。
所有材料经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，凭证样本保存于中国医学科学院药用植物研究所。实验材料及GenBank下载序列信息见表1。
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2 方法
2.1 DNA提取 为避免材料表面的污染，所有实验材料的前处理参照文献进行[25]。取约40 mg经前处理的材料，加入3% 的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，经研磨仪(Retsch MM400， Germany)充分研碎后加入DNA裂解液56 ℃ 水浴过夜，用氯仿-异戊醇(24∶1)抽提2 次，-20 ℃预冷的异丙醇中沉淀DNA，其余步骤按照试剂盒说明进行。
2.2 PCR扩增及测序 ITS2序列的PCR反应体系为25 μL，包括2×Easy Taq PCR SuperMix (TransGen Biotech Co.， China)12.5 μL，2.5 μmol·L-1引物各1 μL、模板DNA约50 ng，ddH2O补足至25 μL。PCR扩增用引物、扩增程序等参考Chen等[11]研究。PCR产物经纯化后，使用ABI 3730XL( Applied Biosystems Co.，USA) 测序仪进行双向测序。
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2.3 数据处理 测序峰图用CondonCode Aligner V3. 7. 1校对拼接，去除低质量序列及引物区，获得 ITS2 序列。所有序列经软件MEGA5.0进行变异位点分析和K2P(Kimura-2-parameter)遗传距离的计算。利用比对法(BLAST1)和最小距离法(Nearest distance)对前胡药材及其混伪品进行鉴定分析。用邻接 (NJ) 法构建系统聚类树， 利用bootstrap(1 000次重复) 检验各分支的支持率。
3 结果
3.1 前胡、紫花前胡药材ITS2序列的种内变异分析 前胡及紫花前胡药材ITS2序列经MEGA5.0分析比对后的片段长度、G+C含量等信息见表1。
不同来源的前胡药材的ITS2序列长度为229～230 bp，分为4个不同的单倍型(表1)，单倍型A1序列全部与KJ680228相同，单倍型A2序列与KJ680226相同，与单倍型A1相比，在208 bp处缺失；KJ680230为单倍型A3，在228 bp处C-T变异； KJ680235为单倍型A4，在54 bp处T-G变异，在82 bp处、190 bp处T-C变异，在146 bp处C-T变异，在155 bp处A-C变异，在163 bp处A-G变异，在182 bp处A缺失。基于K2P模型计算的遗传距离表明，前胡药材ITS2序列的种内K2P遗传距离为0～0.023，平均K2P遗传距离为0.005。不同来源的紫花前胡药材的ITS2序列长度为227 bp，序列种内无变异，同为单倍型B1。, 百拇医药(侯典云 宋经元 杨培 周红 辛天怡 姚辉)