黄连须根浸提液对土壤微生物及酶活性的影响(1)
[摘要] 黄连Coptis chinensis是大量使用的中药材，连作障碍严重。试验在供试土壤中加入不同浓度的黄连须根浸提液(REC)，研究了它们对土壤微生物和酶活性的影响。结果表明，在加入REC的土壤中，微生物碳氮量显著降低，细菌和放线菌比对照降低约60%，但真菌增加3倍左右。自生固氮菌、磷细菌、钾细菌、硝化细菌和氨化细菌均显著减少，说明土壤固(供)氮、溶磷、解钾、促生等功能受到抑制。REC对土壤酶活性的影响表现出多样性，提高转化酶活性，降低脲酶活性，对脱氢酶活性无显著影响，妨碍了土壤生物化学反应的有序进行。此外，REC减少微生物标记性磷脂脂肪酸(PLFAs)种类，降低PLFAs总量，提高真菌/细菌PLFAs比值，说明REC在抑制细菌繁殖生长的同时，相对的增加了真菌数量，致使后续作物容易发生真菌病害。REC还显著降低土壤微生物群落的多样性和均匀度指数，说明加入REC恶化了土壤生态环境，使微生物种群减少，密度降低。因此，在黄连生长过程中，根系分泌的化感物质可能改变土壤微生物种群结构，造成连作障碍。
[关键词] 黄连；土壤；微生物；酶
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黄连Coptis chinensis Franch属毛茛科多年生草本植物，具有清热燥湿，泻火解毒之功效，广泛用于肠道感染，对肺结核、猩红热、急性扁桃腺炎和呼吸道感染等也有一定疗效，是传统的大宗道地中药材[1-2]。在黄连种植过程中，通过茎叶淋溶，根系分泌和植物残体腐解等多种途径向土壤中释放小檗碱(berberine)、黄连碱(coptisine)、巴马汀(palmatine)、药根碱(jatrorrhizine)、甲基黄连碱(worenine)和表小檗碱(epiberberine)、小檗红碱(berberrubine)等化感物质[3]。其中，以小檗碱的分泌量最高，可达总分泌物的80%以上[4]。种植黄连后的土壤必须间隔2～3年才能再次种植，连作障碍极其严重。
相对于棉花-小麦-棉花轮作，棉花连作使土壤微生物种群数减少36.5%，种群结构改变，多样性指数显著降低[5]；在牧草地和种植芒果的土壤中，微生物碳氮量和标记性磷脂脂肪酸总量显著高于菜地，各磷脂脂肪酸的含量也因种植作物不同而异[6]；集约化农业生产降低土壤有机质，微生物种群减少，合理轮作能提供丰富多样的有机质，满足不同微生物的营养需要，微生物活性与种群数显著高于单一种植[7]；在黄花蒿种植过程中，所释放的青蒿素对土壤某些细菌产生抑制作用，土壤微生物的多样性降低，种群结构改变[8]；在种植丹参的根际土壤中，氨化细菌、固氮细菌、有机/无机磷细菌等显著减少，但亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌等微生物种群显著增加。因此可见，种植植物对土壤微生物产生深刻影响。
, 百拇医药
目前，关于黄连根系分泌物对土壤微生物影响的研究甚少，导致对其连作障碍的成因认识不足。此外，微生物是土壤酶的重要来源，其活性及种群对土壤酶产生潜在影响，而土壤酶催化土壤生物化学反应，如氧化还原、有机质降解、硝化与反硝化、腐殖质合成等，故微生物活性、种群与土壤功能密切相关[8]。作者利用不同浓度的黄连须根浸提液，通过培养试验研究了它们对土壤微生物及酶活性的影响，为揭示黄连连作障碍发生机制积累了资料。
1 材料与方法
1.1 供试样品 供试土壤为西南大学农场的中性紫色土，质地中壤、pH 6.68、有机质20.03 g·kg-1、全氮3.32 g·kg-1、有效磷16.43 mg·kg-1、速效钾119.8 mg·kg-1。采集0～20 cm耕作层，拣去杂物，风干，过1 mm 筛，取250 g土壤于500 mL塑料杯中备用。
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供试黄连须根(fibrous root extracts of Coptis chinensis，REC)购自重庆市石柱县黄连有限公司，小檗碱50.20 mg·g-1，(80±1) ℃烘干，粉碎过2 mm筛。准确称取20.00 g，加1 L蒸馏水37 ℃浸泡72 h后抽滤，滤液用去离子水定容至1 L备用。
1.2 试验设计 考虑到1 g·L-1黄连根茎浸提液可抑制幼苗生长[4]，试验分别在供试土壤中加入0，6.25，9.375，12.5，25 mL黄连须根浸提液，即土壤中的黄连须根浸提液质量分数为0，500，750，1 000，2 000 mg·kg-1，相当于小檗碱质量分数为0，25，37.5，50，100 mg·kg-1，混合均匀。然后，加水至土壤最大田间持水量(24.29%)的(70±2)%，(25±1) ℃培养10 d。
1.3 测定项目 利用稀释平板分离计数法测定土壤中的细菌(牛肉膏蛋白胨培养基)、真菌(马丁氏培养基)、放线菌(高氏一号培养基)，自生固氮菌(Ashby无氮培养基)、磷细菌(磷酸钙+植酸培养基)、钾细菌(铝土矿培养基)、氨化细菌(蛋白胨琼脂培养基)和硝化细菌数量(改良Stephenson培养基B)[9-11]，并通过形态和生理生化反应等对自生固氮菌、磷细菌、钾细菌、氨化细菌和硝化细菌数进行鉴定确认，包括革兰氏和芽孢染色、好氧性测定，氧化酶、过氧化氢酶、MR和VP反应，葡萄糖氧化、甘露醇和乳糖发酵，脲素、淀粉和明胶分解，以及 H2S 和吲哚产生、柠檬酸盐、铵盐、硝酸盐、磷酸盐利用等[12]。
, 百拇医药
土壤微生物生物量采用氯仿熏蒸，0.5 mol·L-1 K2SO4 提取，提取液中的微生物碳和氮分别用K2Cr2O7氧化法和凯氏定氮法测定[13]。微生物磷脂脂肪酸(phosphor lipid fatty acids，简称PLFAs)的命名、提取和分析参照Frostegard和Kourtev方法[12]。将从土壤中提取并干燥的PLFAs溶解于正己烷中， 利用气相色谱(Hewlett-Packard 6890)测定， 载气为氦气， 补偿气体为氮气，助燃气体为空气， 流量分别为20～30，30，300 mL·min-1， 初始温度为70 ℃，保持1 min后，以20 ℃·min-1增加到150 ℃，再以5 ℃·min-1升至250 ℃，最后以10 ℃·min-1升至300 ℃。每个样品运行总时间31～32 min。依次采用3，5-二硝基水杨酸比色法、NH4+释放量和TTC比色法测定土壤转化酶、脲酶和脱氢酶活性[14]。, http://www.100md.com(李阳波 何林卫 张薇 吴叶宽 袁玲 黄建国)
[关键词] 黄连；土壤；微生物；酶
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黄连Coptis chinensis Franch属毛茛科多年生草本植物，具有清热燥湿，泻火解毒之功效，广泛用于肠道感染，对肺结核、猩红热、急性扁桃腺炎和呼吸道感染等也有一定疗效，是传统的大宗道地中药材[1-2]。在黄连种植过程中，通过茎叶淋溶，根系分泌和植物残体腐解等多种途径向土壤中释放小檗碱(berberine)、黄连碱(coptisine)、巴马汀(palmatine)、药根碱(jatrorrhizine)、甲基黄连碱(worenine)和表小檗碱(epiberberine)、小檗红碱(berberrubine)等化感物质[3]。其中，以小檗碱的分泌量最高，可达总分泌物的80%以上[4]。种植黄连后的土壤必须间隔2～3年才能再次种植，连作障碍极其严重。
相对于棉花-小麦-棉花轮作，棉花连作使土壤微生物种群数减少36.5%，种群结构改变，多样性指数显著降低[5]；在牧草地和种植芒果的土壤中，微生物碳氮量和标记性磷脂脂肪酸总量显著高于菜地，各磷脂脂肪酸的含量也因种植作物不同而异[6]；集约化农业生产降低土壤有机质，微生物种群减少，合理轮作能提供丰富多样的有机质，满足不同微生物的营养需要，微生物活性与种群数显著高于单一种植[7]；在黄花蒿种植过程中，所释放的青蒿素对土壤某些细菌产生抑制作用，土壤微生物的多样性降低，种群结构改变[8]；在种植丹参的根际土壤中，氨化细菌、固氮细菌、有机/无机磷细菌等显著减少，但亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌等微生物种群显著增加。因此可见，种植植物对土壤微生物产生深刻影响。
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目前，关于黄连根系分泌物对土壤微生物影响的研究甚少，导致对其连作障碍的成因认识不足。此外，微生物是土壤酶的重要来源，其活性及种群对土壤酶产生潜在影响，而土壤酶催化土壤生物化学反应，如氧化还原、有机质降解、硝化与反硝化、腐殖质合成等，故微生物活性、种群与土壤功能密切相关[8]。作者利用不同浓度的黄连须根浸提液，通过培养试验研究了它们对土壤微生物及酶活性的影响，为揭示黄连连作障碍发生机制积累了资料。
1 材料与方法
1.1 供试样品 供试土壤为西南大学农场的中性紫色土，质地中壤、pH 6.68、有机质20.03 g·kg-1、全氮3.32 g·kg-1、有效磷16.43 mg·kg-1、速效钾119.8 mg·kg-1。采集0～20 cm耕作层，拣去杂物，风干，过1 mm 筛，取250 g土壤于500 mL塑料杯中备用。
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供试黄连须根(fibrous root extracts of Coptis chinensis，REC)购自重庆市石柱县黄连有限公司，小檗碱50.20 mg·g-1，(80±1) ℃烘干，粉碎过2 mm筛。准确称取20.00 g，加1 L蒸馏水37 ℃浸泡72 h后抽滤，滤液用去离子水定容至1 L备用。
1.2 试验设计 考虑到1 g·L-1黄连根茎浸提液可抑制幼苗生长[4]，试验分别在供试土壤中加入0，6.25，9.375，12.5，25 mL黄连须根浸提液，即土壤中的黄连须根浸提液质量分数为0，500，750，1 000，2 000 mg·kg-1，相当于小檗碱质量分数为0，25，37.5，50，100 mg·kg-1，混合均匀。然后，加水至土壤最大田间持水量(24.29%)的(70±2)%，(25±1) ℃培养10 d。
1.3 测定项目 利用稀释平板分离计数法测定土壤中的细菌(牛肉膏蛋白胨培养基)、真菌(马丁氏培养基)、放线菌(高氏一号培养基)，自生固氮菌(Ashby无氮培养基)、磷细菌(磷酸钙+植酸培养基)、钾细菌(铝土矿培养基)、氨化细菌(蛋白胨琼脂培养基)和硝化细菌数量(改良Stephenson培养基B)[9-11]，并通过形态和生理生化反应等对自生固氮菌、磷细菌、钾细菌、氨化细菌和硝化细菌数进行鉴定确认，包括革兰氏和芽孢染色、好氧性测定，氧化酶、过氧化氢酶、MR和VP反应，葡萄糖氧化、甘露醇和乳糖发酵，脲素、淀粉和明胶分解，以及 H2S 和吲哚产生、柠檬酸盐、铵盐、硝酸盐、磷酸盐利用等[12]。
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土壤微生物生物量采用氯仿熏蒸，0.5 mol·L-1 K2SO4 提取，提取液中的微生物碳和氮分别用K2Cr2O7氧化法和凯氏定氮法测定[13]。微生物磷脂脂肪酸(phosphor lipid fatty acids，简称PLFAs)的命名、提取和分析参照Frostegard和Kourtev方法[12]。将从土壤中提取并干燥的PLFAs溶解于正己烷中， 利用气相色谱(Hewlett-Packard 6890)测定， 载气为氦气， 补偿气体为氮气，助燃气体为空气， 流量分别为20～30，30，300 mL·min-1， 初始温度为70 ℃，保持1 min后，以20 ℃·min-1增加到150 ℃，再以5 ℃·min-1升至250 ℃，最后以10 ℃·min-1升至300 ℃。每个样品运行总时间31～32 min。依次采用3，5-二硝基水杨酸比色法、NH4+释放量和TTC比色法测定土壤转化酶、脲酶和脱氢酶活性[14]。, http://www.100md.com(李阳波 何林卫 张薇 吴叶宽 袁玲 黄建国)