杜仲雄花中三萜类化学成分研究(1)
[摘要] 该研究采用正相硅胶柱色谱， 反相柱色谱(RP-18)， 凝胶色谱(Sephadex LH-20)以及重结晶等多种分离纯化手段，从杜仲雄花中分离得到9个化合物，通过化合物的理化性质和光谱数据鉴定其结构分别为：3-oxo-12-en-ursane-28-O-α-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside(1)，2α，3β-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid(28→1)-β-D-glucopyranosyl ester(2)， 熊果酸(3)， α-香树脂醇(4)， 熊果醇(5)， 3-O-乙酰基熊果酸乙酸酯(6)， 3-O-乙酰基齐墩果酸(7)， 白桦脂酸(8)， 白桦脂醇(9)。其中化合物1为新化合物， 化合物2， 4～7为首次从该科植物中分离得到。采用MTT法对所分离的9个化合物进行抗肿瘤活性测试，结果表明仅有化合物3对K562和HepG2细胞显示出一定的抗肿瘤活性， 其余化合物对所选的2种细胞均无明显活性。
[关键词] 杜仲雄花；三萜；抗肿瘤活性
, 百拇医药
杜仲又名思仙，为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliver 的干燥树皮，一属一种，是中国名贵滋补药材，《神农本草经》列为上品[1]。杜仲富含次生代谢产物，主要有木脂素、环烯醚萜、黄酮、酚酸、三萜和甾类等[2]。现代药理研究发现，杜仲具有降血压、抗衰老、 抗肿瘤、提高免疫等多种药理作用[3]。
杜仲雄花由于具有镇静和提高免疫等作用，近年来已被开发出多种功能性产品，深受广大消费者喜爱[4]。然而对于杜仲雄花进行系统的化学成分分离的研究报道较少，因此，本实验对杜仲雄花95%的乙醇提取物进行系统的分离研究，从中得到9个三萜类化合物，经光谱数据分析并参照相关文献，分别鉴定为3-oxo-12-en-ursane-28-O-α-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside(1)， 2α，3β-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid(28→1)-β-D-glucopyranosyl ester(2)， 熊果酸(3)， α-香树脂醇(4)， 熊果醇(5)， 3-O-乙酰基熊果酸乙酸酯(6)， 3-O-乙酰基齐墩果酸(7)， 白桦脂酸(8)， 白桦脂醇(9)。
, 百拇医药
本实验分离的三萜类化合物主要为乌苏烷型五环三萜类化合物， 而乌苏烷型三萜化合物很多都具有抗肿瘤活性，如Zhang等[5]发现经过乌苏酸处理后HepG2细胞有凋亡小体的出现，Zhang等[6]发现一种新型的乌苏烷型五环三萜化合物(astilbotriterpenic acid)在体外对K562细胞株具有特异性诱导细胞凋亡的作用。因此本实验选择K562和HepG2 2种细胞株观察杜仲雄花分离得到的三萜类化合物的抗肿瘤活性。
1 材料
Bruker AV-400超导核磁共振仪；Xevo TQD 型质谱仪；Waters Q-Tof 高分辨质谱仪；柱色谱硅胶G(青岛海洋化工有限公司，200～300 目)；RP-18(YMC公司，50 μm)；Sephadex H-20(瑞典Pharmacia公司)。K562和HepG2细胞株够买于中国科学院上海细胞库；其余试剂均为国产分析纯。
, 百拇医药
杜仲雄花2013年3月采摘于河南灵宝，由河南大学药学院李钦教授鉴定为杜仲科植物杜仲E. ulmoides的干燥雄花，标本(标本编号：HNCEU-03)现保存于河南省杜仲栽培与利用工程实验室。
2 提取和分离
杜仲雄花(7 kg)干燥粉碎后，用95%的乙醇加热回流提取2次，每次2 h，减压回收溶剂，得乙醇总浸膏。该浸膏用1.5倍的水分散后，分别用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇等体积萃取3次，回收溶剂，得石油醚部位(100 g)、 醋酸乙酯部位(150 g)、正丁醇部位(250 g)。取正丁醇部位100 g， 经正相硅胶柱色谱，氯仿-甲醇梯度洗脱(9∶1～3∶1) 得5个流分Fr1～Fr5。Fr2部分(2.5 g)经反相(RP-18)柱色谱，甲醇-水(1∶10～1∶5) 梯度洗脱，得到化合物1(12 mg)， 2(8 mg)。醋酸乙酯部位经硅胶柱色谱，石油醚-丙酮梯度洗脱(98∶2～90∶10)，得4个流分A～D，A 部分(4.5 g) 经正相硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯(98∶2～94∶6)梯度洗脱，得到A1～A4部分，A4(89 mg)经反相(RP-18)柱色谱，甲醇-水(8.5∶1) 洗脱得化合物3(11 mg)， 4(150 mg)， 5(25 mg)。B 部分(7.9 g) 经硅胶柱色谱，石油醚-氯仿-丙酮(97∶2∶1～95∶3∶2)得到B1～B3部分，B2部分(102.3 mg)经反相(RP-18)柱色谱，甲醇-水(8∶1) 洗脱，得到化合物6(15 mg)，化合物7(10 mg)。B3部分(100 mg)经反相(RP-18)柱色谱，甲醇-水(9∶1)洗脱，得到化合物8(35 mg)，化合物9(13 mg)。
, 百拇医药
3 结构鉴定
化合物1 白色无定型粉末；Liebermann-Burchard和Molish 反应呈现阳性，初步断定该化合物为三萜苷类化合物。HR-ESI-MS 显示 m/z 757.450 1[M+Na]+(计算值为757.450 5)，推算分子式为C41H66O11。将化合物1进行酸水解并与标准阿拉伯糖、葡萄糖共薄层检查，发现与标准的阿拉伯糖和葡萄糖在相同的位置显示相同颜色的斑点。同时，质谱图上显示m/z 569.326 2的碎片推测可能为 [M-arabinose-H2O+1]+，因此，推断该化合物末端糖可能为阿拉伯糖[7]。1H- NMR 显示有7个甲基质子信号分别为 δH(0.82，3H，d，J=5.2，H-29；0.93，3H，s，H-30；1.05，3H，s，H-24；1.08，3H，s，H-23；1.12，3H，s，H-25；1.12，3H，s H-26；1.15，3H，s，H-27)，1个3取代的烯烃信号δH(5.17，s，H-12)，2个糖的端基质子信号δH (4.95，1H，s，H-1″；4.12，1H，d，J=7.6 Hz，H-1′)。13C-NMR共显示41个碳信号，结合 DEPT-135谱可知其中包括1个羰基碳信号δC 219.1，1组双键信号δC(124.9，138.8)，7个甲基信号δC (14.7，16.1，16.6，20.4，20.6，22.5，25.6)，1组葡萄糖基的信号δC 103.8，73.6，76.6，70.6，75.2，66.6) 和1组阿拉伯糖基信号(δC 108.5，81.7，77.5，84.6，61.6。其中葡萄糖的6位向低场移动到δC 66.6，表明，阿拉伯糖的1位是连接在葡萄糖的6位。将化合物1与已知化合物熊果醇对比发现，化合物1的28位的碳信号向低场位移了7.1，达到δC 76.7，因此考虑化合物1的糖可能连接于C-28，结合化合物1的HMBC谱，葡萄糖的1位H-1′(δH 4.12) 和 C-28(δC 76.8) 有相关信号，证实葡萄糖连在C-28；阿拉伯糖的1位H-1″(δH 4.95)与葡萄糖的6位C-6′(δC 66.6)有相关信号，同时葡萄糖H-6′(δH 3.59，3.98)与阿拉伯糖的C-1″(δC 108.5)，C-4″(δC 84.6 )，C -2″(δC 77.5 )显示远程相关信号，推断阿拉伯糖的1位与葡萄糖的6位相连。另外 H-23(δH 1.08)，H-24(δH 1.05) 与 C-3(δC 219.1) 有远程相关信号，推断羰基位于C-3；H-12(δH 5.17) 与 C-9(δC 46.8)，C-11(δC 23.3)，C-14(δC 41.9)及C-18(δC 54.4) 有明显的相关信号，推断双键位于C-12，13。因此推断化合物1为3-oxo-12-en-ursane-28-O-α-L-arabino-furanosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside。化合物1主要的相关信号，见图1，见表1。, 百拇医药(丁艳霞 王腾宇 张耀文 黄玉梅 马琳 李冬冬 窦德强 李钦)
[关键词] 杜仲雄花；三萜；抗肿瘤活性
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杜仲又名思仙，为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliver 的干燥树皮，一属一种，是中国名贵滋补药材，《神农本草经》列为上品[1]。杜仲富含次生代谢产物，主要有木脂素、环烯醚萜、黄酮、酚酸、三萜和甾类等[2]。现代药理研究发现，杜仲具有降血压、抗衰老、 抗肿瘤、提高免疫等多种药理作用[3]。
杜仲雄花由于具有镇静和提高免疫等作用，近年来已被开发出多种功能性产品，深受广大消费者喜爱[4]。然而对于杜仲雄花进行系统的化学成分分离的研究报道较少，因此，本实验对杜仲雄花95%的乙醇提取物进行系统的分离研究，从中得到9个三萜类化合物，经光谱数据分析并参照相关文献，分别鉴定为3-oxo-12-en-ursane-28-O-α-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside(1)， 2α，3β-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid(28→1)-β-D-glucopyranosyl ester(2)， 熊果酸(3)， α-香树脂醇(4)， 熊果醇(5)， 3-O-乙酰基熊果酸乙酸酯(6)， 3-O-乙酰基齐墩果酸(7)， 白桦脂酸(8)， 白桦脂醇(9)。
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本实验分离的三萜类化合物主要为乌苏烷型五环三萜类化合物， 而乌苏烷型三萜化合物很多都具有抗肿瘤活性，如Zhang等[5]发现经过乌苏酸处理后HepG2细胞有凋亡小体的出现，Zhang等[6]发现一种新型的乌苏烷型五环三萜化合物(astilbotriterpenic acid)在体外对K562细胞株具有特异性诱导细胞凋亡的作用。因此本实验选择K562和HepG2 2种细胞株观察杜仲雄花分离得到的三萜类化合物的抗肿瘤活性。
1 材料
Bruker AV-400超导核磁共振仪；Xevo TQD 型质谱仪；Waters Q-Tof 高分辨质谱仪；柱色谱硅胶G(青岛海洋化工有限公司，200～300 目)；RP-18(YMC公司，50 μm)；Sephadex H-20(瑞典Pharmacia公司)。K562和HepG2细胞株够买于中国科学院上海细胞库；其余试剂均为国产分析纯。
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杜仲雄花2013年3月采摘于河南灵宝，由河南大学药学院李钦教授鉴定为杜仲科植物杜仲E. ulmoides的干燥雄花，标本(标本编号：HNCEU-03)现保存于河南省杜仲栽培与利用工程实验室。
2 提取和分离
杜仲雄花(7 kg)干燥粉碎后，用95%的乙醇加热回流提取2次，每次2 h，减压回收溶剂，得乙醇总浸膏。该浸膏用1.5倍的水分散后，分别用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇等体积萃取3次，回收溶剂，得石油醚部位(100 g)、 醋酸乙酯部位(150 g)、正丁醇部位(250 g)。取正丁醇部位100 g， 经正相硅胶柱色谱，氯仿-甲醇梯度洗脱(9∶1～3∶1) 得5个流分Fr1～Fr5。Fr2部分(2.5 g)经反相(RP-18)柱色谱，甲醇-水(1∶10～1∶5) 梯度洗脱，得到化合物1(12 mg)， 2(8 mg)。醋酸乙酯部位经硅胶柱色谱，石油醚-丙酮梯度洗脱(98∶2～90∶10)，得4个流分A～D，A 部分(4.5 g) 经正相硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯(98∶2～94∶6)梯度洗脱，得到A1～A4部分，A4(89 mg)经反相(RP-18)柱色谱，甲醇-水(8.5∶1) 洗脱得化合物3(11 mg)， 4(150 mg)， 5(25 mg)。B 部分(7.9 g) 经硅胶柱色谱，石油醚-氯仿-丙酮(97∶2∶1～95∶3∶2)得到B1～B3部分，B2部分(102.3 mg)经反相(RP-18)柱色谱，甲醇-水(8∶1) 洗脱，得到化合物6(15 mg)，化合物7(10 mg)。B3部分(100 mg)经反相(RP-18)柱色谱，甲醇-水(9∶1)洗脱，得到化合物8(35 mg)，化合物9(13 mg)。
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3 结构鉴定
化合物1 白色无定型粉末；Liebermann-Burchard和Molish 反应呈现阳性，初步断定该化合物为三萜苷类化合物。HR-ESI-MS 显示 m/z 757.450 1[M+Na]+(计算值为757.450 5)，推算分子式为C41H66O11。将化合物1进行酸水解并与标准阿拉伯糖、葡萄糖共薄层检查，发现与标准的阿拉伯糖和葡萄糖在相同的位置显示相同颜色的斑点。同时，质谱图上显示m/z 569.326 2的碎片推测可能为 [M-arabinose-H2O+1]+，因此，推断该化合物末端糖可能为阿拉伯糖[7]。1H- NMR 显示有7个甲基质子信号分别为 δH(0.82，3H，d，J=5.2，H-29；0.93，3H，s，H-30；1.05，3H，s，H-24；1.08，3H，s，H-23；1.12，3H，s，H-25；1.12，3H，s H-26；1.15，3H，s，H-27)，1个3取代的烯烃信号δH(5.17，s，H-12)，2个糖的端基质子信号δH (4.95，1H，s，H-1″；4.12，1H，d，J=7.6 Hz，H-1′)。13C-NMR共显示41个碳信号，结合 DEPT-135谱可知其中包括1个羰基碳信号δC 219.1，1组双键信号δC(124.9，138.8)，7个甲基信号δC (14.7，16.1，16.6，20.4，20.6，22.5，25.6)，1组葡萄糖基的信号δC 103.8，73.6，76.6，70.6，75.2，66.6) 和1组阿拉伯糖基信号(δC 108.5，81.7，77.5，84.6，61.6。其中葡萄糖的6位向低场移动到δC 66.6，表明，阿拉伯糖的1位是连接在葡萄糖的6位。将化合物1与已知化合物熊果醇对比发现，化合物1的28位的碳信号向低场位移了7.1，达到δC 76.7，因此考虑化合物1的糖可能连接于C-28，结合化合物1的HMBC谱，葡萄糖的1位H-1′(δH 4.12) 和 C-28(δC 76.8) 有相关信号，证实葡萄糖连在C-28；阿拉伯糖的1位H-1″(δH 4.95)与葡萄糖的6位C-6′(δC 66.6)有相关信号，同时葡萄糖H-6′(δH 3.59，3.98)与阿拉伯糖的C-1″(δC 108.5)，C-4″(δC 84.6 )，C -2″(δC 77.5 )显示远程相关信号，推断阿拉伯糖的1位与葡萄糖的6位相连。另外 H-23(δH 1.08)，H-24(δH 1.05) 与 C-3(δC 219.1) 有远程相关信号，推断羰基位于C-3；H-12(δH 5.17) 与 C-9(δC 46.8)，C-11(δC 23.3)，C-14(δC 41.9)及C-18(δC 54.4) 有明显的相关信号，推断双键位于C-12，13。因此推断化合物1为3-oxo-12-en-ursane-28-O-α-L-arabino-furanosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside。化合物1主要的相关信号，见图1，见表1。, 百拇医药(丁艳霞 王腾宇 张耀文 黄玉梅 马琳 李冬冬 窦德强 李钦)