穿心莲UPLC—PDA指纹图谱研究及4种内酯类成分含量测定(1)
[摘要] 分析研究不同部位及产地穿心莲药材，为穿心莲相关制剂工艺提供依据。以穿心莲内酯峰为参照，确定了27个共有指纹峰，建立了23批穿心莲药材的UPLC-PDA数字化定量指纹图谱，特征提取后对其进行主成分分析(PCA)；采用外标法测定23批穿心莲药材中穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯成分含量，并采用Plackett-Burman试验设计结合pareto图研究耐用性因素对方法的影响。结果发现，穿心莲药材部位比产地对药材质量的影响更显著；药材不同部位4种内酯含量差异大；流动相pH是影响方法耐用性较大的因素。
[关键词] 穿心莲；指纹图谱；含量测定；PCA；Plackett-Burman设计
穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.) Ness的干燥地上部分。味苦，性寒，归心、肺、大肠、膀胱经，清热解毒、凉血消肿。用于感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，蛇虫咬伤[1]。前期研究多为单独测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量作为质量研究和控制指标[2-3]，本实验首次建立不同产地和部位穿心莲药材UPLC-PDA指纹图谱结合主成分分析(PCA)判别产地和部位对穿心莲药材质量的影响；并对穿心莲中主要的4个二萜内酯类成分进行了同时定量分析，使用Plackett-Burman实验设计考察了不同因素对实验方法耐用性的影响大小，为提高穿心莲相关制剂的质量控制以及合理的方法开发和应用提供依据。
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1 材料
Acquity UPLC(美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、PDA检测器、Empower3色谱工作站)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XS105型1/10万分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Millipore Simplicity超纯水系统。
乙腈、甲醇(色谱纯，Merck)；甲酸(色谱纯，天津光复精细化工研究所)；穿心莲内酯对照品(批号201007，98.70%)，脱水穿心莲内酯对照品(批号201007，99.70%)购于中国食品药品检定研究院；新穿心莲内酯对照品(批号AD728N，98.18%)，去氧穿心莲内酯对照品(批号AD159D，99.18%)购于天津一方科技公司。
穿心莲药材自广东湛江遂溪城月镇、广西贵港桥圩镇、福建漳州漳浦县、广西南宁横县等地种植农户处收集，人工割取地上部分后，晒干，即得全草样品，利用脱叶机等处理即得叶和杆样品。样品收集后放置在温度20 ℃，相对湿度小于40%的避光环境中保存，经上海中医药大学侴桂新教授鉴定为穿心莲A. paniculata。实验前粉碎，过40目筛，备用。各样品编号和信息见表1。
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2 方法与结果
2.1 指纹图谱的建立
2.1.1 色谱条件
采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm， 1.7 μm)；流动相A为甲醇-乙腈1∶9混合，流动相B为0.3%甲酸水溶液；进样量为2 μL；色谱柱温度25 ℃；以穿心莲内酯为参照物，指纹图谱检测波长249 nm，含量测定波长为224 nm；梯度洗脱程序见表2。
2.1.2 对照品溶液的制备
分别称取穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯对照品适量于25 mL量瓶中，用80%甲醇配制成含穿心莲内酯1 199 mg·L-1，新穿心莲内酯199.0 mg·L-1，去氧穿心莲内酯191.0 mg·L-1，脱水穿心莲内酯 459.0 mg·L-1的混合对照品储备液。
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2.1.3 供试品溶液的制备
取23批穿心莲药材粉末各500 mg，精密称定，置于25mL量瓶中，用 80%甲醇定容，超声提取20 min，放至室温，加80%甲醇补足失重量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.1.4 系统适用性试验
取供试品(S13)溶液和对照品溶液(取5 mL对照品储备液于10 mL量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度)，按照2.1.1项下色谱条件检测，记录色谱图，并确定27个共有峰，见图1。比较PDA谱图确定供试品UPLC图中17号峰(为穿心莲内酯峰。以17号峰计算，理论塔板数267 482，分离度1.80，拖尾因子1.01，说明方法系统适用性良好。
2.1.5 精密度试验
取供试品溶液(S13)，按照2.1.1项下方法连续进样6次，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<2%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱技术要求。
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2.1.6 重复性试验
取S13穿心莲药材6份，精密称定，分别按2.1.3项下方法制备供试品溶液并按照2.1.1项下方法测定，其共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<2%，符合指纹图谱技术要求。
2.1.7 稳定性试验
取供试品溶液(S13)，20 ℃放置，分别在0，2，4，6，8，10，12，24 h进样，按照2.1.1项下方法测定，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.1.8 穿心莲药材指纹图谱的建立
取23批穿心莲药材样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下方法进行检测，以17号峰(穿心莲内酯)为参比峰，计算27个共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积。
将积分信号导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件[4]，按平均值法计算生成标准对照指纹图谱，见图2。计算23批样品与对照图谱的相似度，分别为0.586，0.591，0.987，0.989，0.995，0.951，0.982，0.957，0.954，0.976，0.990，0.945，0.994，0.876，0.553，0.998，0.990，0.999，0.934，0.839，0.978，0.999，0.974其中S1，S2，S15的相似度低，提示药材部位成分含量可能有差别。, http://www.100md.com(黄竞怡 刘小琳 周水平 佟玲 丁黎)
[关键词] 穿心莲；指纹图谱；含量测定；PCA；Plackett-Burman设计
穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.) Ness的干燥地上部分。味苦，性寒，归心、肺、大肠、膀胱经，清热解毒、凉血消肿。用于感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，蛇虫咬伤[1]。前期研究多为单独测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量作为质量研究和控制指标[2-3]，本实验首次建立不同产地和部位穿心莲药材UPLC-PDA指纹图谱结合主成分分析(PCA)判别产地和部位对穿心莲药材质量的影响；并对穿心莲中主要的4个二萜内酯类成分进行了同时定量分析，使用Plackett-Burman实验设计考察了不同因素对实验方法耐用性的影响大小，为提高穿心莲相关制剂的质量控制以及合理的方法开发和应用提供依据。
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1 材料
Acquity UPLC(美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、PDA检测器、Empower3色谱工作站)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XS105型1/10万分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；Millipore Simplicity超纯水系统。
乙腈、甲醇(色谱纯，Merck)；甲酸(色谱纯，天津光复精细化工研究所)；穿心莲内酯对照品(批号201007，98.70%)，脱水穿心莲内酯对照品(批号201007，99.70%)购于中国食品药品检定研究院；新穿心莲内酯对照品(批号AD728N，98.18%)，去氧穿心莲内酯对照品(批号AD159D，99.18%)购于天津一方科技公司。
穿心莲药材自广东湛江遂溪城月镇、广西贵港桥圩镇、福建漳州漳浦县、广西南宁横县等地种植农户处收集，人工割取地上部分后，晒干，即得全草样品，利用脱叶机等处理即得叶和杆样品。样品收集后放置在温度20 ℃，相对湿度小于40%的避光环境中保存，经上海中医药大学侴桂新教授鉴定为穿心莲A. paniculata。实验前粉碎，过40目筛，备用。各样品编号和信息见表1。
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2 方法与结果
2.1 指纹图谱的建立
2.1.1 色谱条件
采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm， 1.7 μm)；流动相A为甲醇-乙腈1∶9混合，流动相B为0.3%甲酸水溶液；进样量为2 μL；色谱柱温度25 ℃；以穿心莲内酯为参照物，指纹图谱检测波长249 nm，含量测定波长为224 nm；梯度洗脱程序见表2。
2.1.2 对照品溶液的制备
分别称取穿心莲内酯，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯，脱水穿心莲内酯对照品适量于25 mL量瓶中，用80%甲醇配制成含穿心莲内酯1 199 mg·L-1，新穿心莲内酯199.0 mg·L-1，去氧穿心莲内酯191.0 mg·L-1，脱水穿心莲内酯 459.0 mg·L-1的混合对照品储备液。
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取23批穿心莲药材粉末各500 mg，精密称定，置于25mL量瓶中，用 80%甲醇定容，超声提取20 min，放至室温，加80%甲醇补足失重量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.1.4 系统适用性试验
取供试品(S13)溶液和对照品溶液(取5 mL对照品储备液于10 mL量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度)，按照2.1.1项下色谱条件检测，记录色谱图，并确定27个共有峰，见图1。比较PDA谱图确定供试品UPLC图中17号峰(为穿心莲内酯峰。以17号峰计算，理论塔板数267 482，分离度1.80，拖尾因子1.01，说明方法系统适用性良好。
2.1.5 精密度试验
取供试品溶液(S13)，按照2.1.1项下方法连续进样6次，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<2%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱技术要求。
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2.1.6 重复性试验
取S13穿心莲药材6份，精密称定，分别按2.1.3项下方法制备供试品溶液并按照2.1.1项下方法测定，其共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<2%，符合指纹图谱技术要求。
2.1.7 稳定性试验
取供试品溶液(S13)，20 ℃放置，分别在0，2，4，6，8，10，12，24 h进样，按照2.1.1项下方法测定，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.1.8 穿心莲药材指纹图谱的建立
取23批穿心莲药材样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下方法进行检测，以17号峰(穿心莲内酯)为参比峰，计算27个共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积。
将积分信号导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件[4]，按平均值法计算生成标准对照指纹图谱，见图2。计算23批样品与对照图谱的相似度，分别为0.586，0.591，0.987，0.989，0.995，0.951，0.982，0.957，0.954，0.976，0.990，0.945，0.994，0.876，0.553，0.998，0.990，0.999，0.934，0.839，0.978，0.999，0.974其中S1，S2，S15的相似度低，提示药材部位成分含量可能有差别。, http://www.100md.com(黄竞怡 刘小琳 周水平 佟玲 丁黎)