黄芪甲苷的生物样品稳定性考察及在大鼠体外肠菌中代谢转化研究(1)
[摘要] 为明确黄芪甲苷(AST) 在生物样品中的稳定性和在大鼠体外肠菌代谢转化产物及代谢途径。本实验采用体外的方法对AST在人工胃液、人工肠液及大鼠肝匀浆中的稳定性以及大鼠离体肠道菌群中的代谢产物进行探讨。采用HPLC法测定AST在生物样本中的含量，计算AST在生物样本中的剩余百分率。采用TLC，HPLC和LC-MS/MS相结合的分析手段，鉴定代谢产物。结果发现，AST在人工胃液、人工肠液及肝脏中均较稳定，不易代谢；AST肠道菌群的代谢是通过脱糖基逐级进行的。首先，失去3位木糖基转化成次生代谢产物环黄芪醇-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CMG)。然后，失去6位葡萄糖基得到极性更小的皂苷元环黄芪醇(CAG)。研究结果表明AST在体内主要在肠道代谢，发生糖基水解作用。即肠道菌群的水解作用是AST代谢的主要原因。
[关键词] 黄芪甲苷；稳定性；体外；肠菌代谢；代谢产物；代谢途径
黄芪为著名传统补气类中药，始载于《神农本草经》，具有扶正固本、益气活血、延缓衰老，调节免疫系统，抗菌及抑制病毒作用，降血糖及减少糖尿病并发症作用[1]。
, 百拇医药
黄芪甲苷(AST)又称黄芪皂苷Ⅳ，为黄芪内主要有效成分[2]。AST为大分子皂苷，其口服生物利用度不足3%，通过改变剂型等各种方式虽然提高了口服利用度[3-4]，但是AST吸收差的原因尚不清楚。目前很多研究证实皂苷类物质口服后在体内发生糖基水解，经肠道菌群转化后，代谢产物包括皂苷元作为主要物质进入血液发挥更大的药理作用[5]。然而，针对AST在体内吸收代谢转化及真正发挥药效的成分等问题鲜有报道。因而，本实验首先对AST在胃肠环境中的稳定性进行研究，然后探讨其体外的代谢特性，明确其代谢过程及转化部位，为新药和保健品合理开发提供实验依据。
1 材料
1.1 仪器
Thermo Scientific液相色谱-质谱仪(Accela UV/Vis Detector， Accela Auto Sampler， Accela 600 pump， TSQ Quantum Access)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；高速离心机(北京白洋离心机厂)；TGL20M型高速冷冻离心机(长沙湘智志离心机仪器有限公司)；T10 basic电动匀浆机(德国IKA公司)；VORTEX GENIVS 3 漩涡混匀仪(IKA)；DKZ-450B型电热恒温振荡水槽(上海森信实验仪器有限公司)；MTN-2800D 型氮气吹干仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；C18 SPE柱(Agilent Technologies)；薄层层析硅胶-G预制板(青岛海洋化工厂)。
, 百拇医药
1.2 试药
AST和环黄芪醇(CAG)由北京美迪克斯生物技术有限公司提供(纯度>98%)；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、胃蛋白酶和胰蛋白酶(北京拜尔迪生物技术有限公司)；氧化型辅酶Ⅱ(NADPNa2)、葡萄糖-6-磷酸二钠(G-6-P-Na)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)为Sigma 产品(中生瑞泰有限公司)。实验中所用其他试剂均为市售色谱纯或分析纯。实验用水为娃哈哈纯净水。
1.3 动物
清洁级Sprague Dawley(SD)大鼠，体重(220±20) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2011-0012。
2 方法
2.1 溶液配制
, http://www.100md.com
人工胃液和人工肠液：参照文献方法[6]制备。
AST供试品储备液制备：精密称取AST适量，加甲醇溶解，配制成质量浓度为5.0 g·L-1的AST储备液，使用时用甲醇稀释成所需浓度即可。
AST对照品溶液制备：精密称取AST对照品适量，加甲醇配制成质量浓度为0.1 g·L-1的溶液，作为AST对照品溶液。
CAG对照品溶液制备：精密称取CAG对照品适量，加甲醇配制成质量浓度为0.1 g·L-1的溶液，作为CAG对照品溶液。
2.2 TLC、HPLC及HPLC-MS检测条件
TLC法条件：硅胶-G薄层预制板，展开系统：CHCl3-CH3OH-H2O(8∶3∶1)，10%浓硫酸乙醇溶液105 ℃加热5 min显色。
, 百拇医药
HPLC条件：Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm， 5 μm)；检测波长203 nm；流速1 mL·min-1；柱温为30 ℃；流动相为乙腈-水梯度洗脱0～20 min，乙腈的比例由37%变化到55%，水的比例由63%变化到45%。进样体积30 μL。
HPLC-MS条件：流动相为乙腈-0.01%甲酸，液相条件同该项下的HPLC条件。正离子检测模式；喷雾电压3 kV；喷雾温度400 ℃；毛细管温度270 ℃；鞘气(N2)20；辅助气(Ar)5；进样量5 μL。
2.3 AST的稳定性
2.3.1 AST在人工胃液中的稳定性 吸取AST储备液100 μL与10 mL预温孵至37 ℃的人工胃液混合后，置于37 ℃恒温振荡水浴中。平行制备3份。同时制备不加AST的空白样品。分别于反应0， 0.5， 1， 2， 3， 4 h取样，每个时间点取0.5 mL。在取出的样品中迅速加入1倍乙腈终止反应并沉淀蛋白，涡旋1 min使终止完全。将样品高速离心(15 000 r·min-1，20 min)，取上清，HPLC进样分析。
2.3.2 AST在人工肠液中的稳定性 同2.3.1操作，将AST与人工肠液共温孵，分别于0， 0.5， 1， 2， 3， 4 h取样、处理。取上清，HPLC进样分析。, 百拇医药(孙桂霞 赵园园 苗培培 杨晓燕 苗青 李静 薛宝娟 苏谨 张玉杰)
[关键词] 黄芪甲苷；稳定性；体外；肠菌代谢；代谢产物；代谢途径
黄芪为著名传统补气类中药，始载于《神农本草经》，具有扶正固本、益气活血、延缓衰老，调节免疫系统，抗菌及抑制病毒作用，降血糖及减少糖尿病并发症作用[1]。
, 百拇医药
黄芪甲苷(AST)又称黄芪皂苷Ⅳ，为黄芪内主要有效成分[2]。AST为大分子皂苷，其口服生物利用度不足3%，通过改变剂型等各种方式虽然提高了口服利用度[3-4]，但是AST吸收差的原因尚不清楚。目前很多研究证实皂苷类物质口服后在体内发生糖基水解，经肠道菌群转化后，代谢产物包括皂苷元作为主要物质进入血液发挥更大的药理作用[5]。然而，针对AST在体内吸收代谢转化及真正发挥药效的成分等问题鲜有报道。因而，本实验首先对AST在胃肠环境中的稳定性进行研究，然后探讨其体外的代谢特性，明确其代谢过程及转化部位，为新药和保健品合理开发提供实验依据。
1 材料
1.1 仪器
Thermo Scientific液相色谱-质谱仪(Accela UV/Vis Detector， Accela Auto Sampler， Accela 600 pump， TSQ Quantum Access)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；高速离心机(北京白洋离心机厂)；TGL20M型高速冷冻离心机(长沙湘智志离心机仪器有限公司)；T10 basic电动匀浆机(德国IKA公司)；VORTEX GENIVS 3 漩涡混匀仪(IKA)；DKZ-450B型电热恒温振荡水槽(上海森信实验仪器有限公司)；MTN-2800D 型氮气吹干仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；C18 SPE柱(Agilent Technologies)；薄层层析硅胶-G预制板(青岛海洋化工厂)。
, 百拇医药
1.2 试药
AST和环黄芪醇(CAG)由北京美迪克斯生物技术有限公司提供(纯度>98%)；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、胃蛋白酶和胰蛋白酶(北京拜尔迪生物技术有限公司)；氧化型辅酶Ⅱ(NADPNa2)、葡萄糖-6-磷酸二钠(G-6-P-Na)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)为Sigma 产品(中生瑞泰有限公司)。实验中所用其他试剂均为市售色谱纯或分析纯。实验用水为娃哈哈纯净水。
1.3 动物
清洁级Sprague Dawley(SD)大鼠，体重(220±20) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2011-0012。
2 方法
2.1 溶液配制
, http://www.100md.com
人工胃液和人工肠液：参照文献方法[6]制备。
AST供试品储备液制备：精密称取AST适量，加甲醇溶解，配制成质量浓度为5.0 g·L-1的AST储备液，使用时用甲醇稀释成所需浓度即可。
AST对照品溶液制备：精密称取AST对照品适量，加甲醇配制成质量浓度为0.1 g·L-1的溶液，作为AST对照品溶液。
CAG对照品溶液制备：精密称取CAG对照品适量，加甲醇配制成质量浓度为0.1 g·L-1的溶液，作为CAG对照品溶液。
2.2 TLC、HPLC及HPLC-MS检测条件
TLC法条件：硅胶-G薄层预制板，展开系统：CHCl3-CH3OH-H2O(8∶3∶1)，10%浓硫酸乙醇溶液105 ℃加热5 min显色。
, 百拇医药
HPLC条件：Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm， 5 μm)；检测波长203 nm；流速1 mL·min-1；柱温为30 ℃；流动相为乙腈-水梯度洗脱0～20 min，乙腈的比例由37%变化到55%，水的比例由63%变化到45%。进样体积30 μL。
HPLC-MS条件：流动相为乙腈-0.01%甲酸，液相条件同该项下的HPLC条件。正离子检测模式；喷雾电压3 kV；喷雾温度400 ℃；毛细管温度270 ℃；鞘气(N2)20；辅助气(Ar)5；进样量5 μL。
2.3 AST的稳定性
2.3.1 AST在人工胃液中的稳定性 吸取AST储备液100 μL与10 mL预温孵至37 ℃的人工胃液混合后，置于37 ℃恒温振荡水浴中。平行制备3份。同时制备不加AST的空白样品。分别于反应0， 0.5， 1， 2， 3， 4 h取样，每个时间点取0.5 mL。在取出的样品中迅速加入1倍乙腈终止反应并沉淀蛋白，涡旋1 min使终止完全。将样品高速离心(15 000 r·min-1，20 min)，取上清，HPLC进样分析。
2.3.2 AST在人工肠液中的稳定性 同2.3.1操作，将AST与人工肠液共温孵，分别于0， 0.5， 1， 2， 3， 4 h取样、处理。取上清，HPLC进样分析。, 百拇医药(孙桂霞 赵园园 苗培培 杨晓燕 苗青 李静 薛宝娟 苏谨 张玉杰)