HPLC—Q—TOF—MS和UPLC—QqQ—MS的三叶青主要成分定性与定量研究(1)
[摘要]建立高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法(HPLC-Q-TOF-MS)快速鉴定三叶青化学成分，建立超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法(UPLC-QqQ-MS)同时测定三叶青中4种成分(芦丁、异槲皮苷、山柰酚芸香糖苷、紫云英苷)的含量。HPLC-Q-TOF-MS法采用月旭Ultimate-XB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm， 5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)梯度洗脱，流速0.8 mL·min-1，柱温30 ℃。飞行时间质谱，采用负离子模式扫描。UPLC-QqQ-MS法采用Waters CORTECS C18 (2.1 mm×100 mm， 1.6 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)梯度洗脱，柱温45 ℃，采用负离子多反应监测(MRM)方式进行含量测定。结果HPLC-Q-TOF-MS法推断鉴定了三叶青中的24种成分，UPLC-QqQ-MS法定量分析三叶青中4种成分在考察的浓度范围内，线性关系良好(r>0.996 6) ；回收率均在98.27%～101.6%，RSD 3.2%～5.9%。通过HPLC-Q-TOF-MS联用技术，为鉴定三叶青的化学成分提供了一种快速、高效的定性分析方法。建立的UPLC-QqQ- MS同时测定三叶青中4种成分的定量分析方法简便、快捷、准确，为综合评价三叶青的质量提供参考。
, 百拇医药
[关键词]三叶青；HPLC-Q-TOF-MS；UPLC-QqQ-MS；质量控制
三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum，其块根名为蛇附子，异名有石猴子、石抱子、拦山虎、雷胆子、破石珠、阴灵子、三叶扁藤、金丝吊葫芦，是福建、浙江地区传统习用青草药，习称为“一粒珠”。三叶青以块根入药，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能，现代药理研究表明三叶青具有抗炎、镇痛及解热、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫[1]等作用，并广泛用于多种中成药或保健品，如华佗风痛宝、结石康胶囊、三叶青粉末、金丝地甲胶囊、金芪片等。三叶青中的化学成分研究已有报道[2-5]，但以这些分离得到的成分为指标的质量控制却未见报道。近来，HPLC-Q-TOF-MS技术广泛运用于中药及复方多成分的鉴定上[6-7]，通过液相色谱分离，利用串联高分辨飞行时间质谱的精确分子量定性优势，全面而快速对中药多成分进行准确鉴定。另外，目前关于三叶青块根药材质量控制的研究报道也较少[8-9]，因此本文采用HPLC-Q-TOF-MS对三叶青化学成分进行全面定性分析，同时采用UPLC-QqQ-MS法对其4种主要成分进行定量分析，为三叶青的质量控制提供新的科学依据。
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1仪器与试药
MicrOTOF飞行时间质谱仪(德国Bruker公司)；Xevo TQMS三重四级杆质谱(美国Waters公司)；CPA225D 型1/10万分析天平(德国Sartorius公司)；KQ-500E 台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FY135型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；乙腈为色谱纯(德国MERCK公司)；Milli-Q 超纯水(美国Millipore公司)；其余试剂均为分析纯。
对照品芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷及紫云英苷由本实验室分离制备，1H，13C-NMR和MS数据与文献[10]比较确认；纯度经HPLC-DAD(面积归一法)检测含量均大于98.0%。儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、原花青素B1、原花青素B2、山柰酚-3-O-新橙皮苷和对羟基苯甲酸由本实验室从三叶青中分得，供QTOF定性鉴定比对使用；内标甘草苷购自上海同田生物技术股份有限公司，新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸购自北京赛百草科技有限公司。三叶青26批样品分别采自或购自不同产地，经福建中医药大学药用植物实验室范世明高级实验师及生药教研室黄泽豪副教授鉴定，均为葡萄科植物三叶青T. hemsleyanum的干燥块根，样本存放于福建中医药大学药学院药用植物标本室。
, 百拇医药
2方法与结果
2.1色谱及质谱条件
2.1.1HPLC-Q-TOF-MS分析色谱条件为月旭Ultimate-XB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm， 5 μm)，流动相乙腈(A)-(0.1%甲酸)水(B)，梯度洗脱(0～5 min， 5%～10%A； 5～30 min， 10%～15%A； 30～40 min， 15%～18%A； 40～50 min， 18%～23%A； 50～60 min， 23%～37%A； 60～70 min， 37%～70%A； 70～100 min， 70%A)，流速0.8 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量2 μL。质谱条件为飞行时间质谱采用电喷雾负离子模式：毛细管电压 4.5 kV，喷雾器压力 2.0 bar，干燥气体(N2)流速 4.0 L·min-1，干燥气体温度 180 ℃，funnel 1∶200.0 Vpp， funnel 2∶200.0 Vpp，hexapole Rf 100.0 Vpp，四级杆离子能量 3.0 eV，collision Rf 150.0 Vpp，离子传输时间 80 μs，前脉冲存储时间 5 μs，碰撞气体氩气，碰撞能量 30 eV。质谱测定数据采用全扫描模式采集，数据采集范围m/z 50～1 000。
2.1.2UPLC-QqQ-MS法定量分析色谱条件Waters CORTECS C18 (2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，流动相乙腈(A)-(0.1%甲酸)水(B)，梯度洗脱(0～0.5 min， 8%～10%A； 0.5～2.5 min， 10%～15%A； 2.5～4.5 min， 15%～20%A； 4.5～6.5 min， 20%～40%A；6.5～8.5 min， 10%～10%A)，流速 0.25 mL·min-1，柱温45 ℃，进样量1 μL。质谱条件：电喷雾负离子模式，毛细管电压 2.5 kv，锥孔电压50 v，脱溶剂气流 N2 800 L·h-1，脱溶剂温度 200 ℃，锥孔气流 N2 50 L·h-1，离子源温度 150 ℃，Extractor 3.00 V，碰撞气体氩气。, 百拇医药(许文 傅志勤 林婧 黄学城 陈丹 于虹敏 黄泽豪 范世明)
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[关键词]三叶青；HPLC-Q-TOF-MS；UPLC-QqQ-MS；质量控制
三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum，其块根名为蛇附子，异名有石猴子、石抱子、拦山虎、雷胆子、破石珠、阴灵子、三叶扁藤、金丝吊葫芦，是福建、浙江地区传统习用青草药，习称为“一粒珠”。三叶青以块根入药，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能，现代药理研究表明三叶青具有抗炎、镇痛及解热、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫[1]等作用，并广泛用于多种中成药或保健品，如华佗风痛宝、结石康胶囊、三叶青粉末、金丝地甲胶囊、金芪片等。三叶青中的化学成分研究已有报道[2-5]，但以这些分离得到的成分为指标的质量控制却未见报道。近来，HPLC-Q-TOF-MS技术广泛运用于中药及复方多成分的鉴定上[6-7]，通过液相色谱分离，利用串联高分辨飞行时间质谱的精确分子量定性优势，全面而快速对中药多成分进行准确鉴定。另外，目前关于三叶青块根药材质量控制的研究报道也较少[8-9]，因此本文采用HPLC-Q-TOF-MS对三叶青化学成分进行全面定性分析，同时采用UPLC-QqQ-MS法对其4种主要成分进行定量分析，为三叶青的质量控制提供新的科学依据。
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1仪器与试药
MicrOTOF飞行时间质谱仪(德国Bruker公司)；Xevo TQMS三重四级杆质谱(美国Waters公司)；CPA225D 型1/10万分析天平(德国Sartorius公司)；KQ-500E 台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FY135型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；乙腈为色谱纯(德国MERCK公司)；Milli-Q 超纯水(美国Millipore公司)；其余试剂均为分析纯。
对照品芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷及紫云英苷由本实验室分离制备，1H，13C-NMR和MS数据与文献[10]比较确认；纯度经HPLC-DAD(面积归一法)检测含量均大于98.0%。儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、原花青素B1、原花青素B2、山柰酚-3-O-新橙皮苷和对羟基苯甲酸由本实验室从三叶青中分得，供QTOF定性鉴定比对使用；内标甘草苷购自上海同田生物技术股份有限公司，新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸购自北京赛百草科技有限公司。三叶青26批样品分别采自或购自不同产地，经福建中医药大学药用植物实验室范世明高级实验师及生药教研室黄泽豪副教授鉴定，均为葡萄科植物三叶青T. hemsleyanum的干燥块根，样本存放于福建中医药大学药学院药用植物标本室。
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2方法与结果
2.1色谱及质谱条件
2.1.1HPLC-Q-TOF-MS分析色谱条件为月旭Ultimate-XB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm， 5 μm)，流动相乙腈(A)-(0.1%甲酸)水(B)，梯度洗脱(0～5 min， 5%～10%A； 5～30 min， 10%～15%A； 30～40 min， 15%～18%A； 40～50 min， 18%～23%A； 50～60 min， 23%～37%A； 60～70 min， 37%～70%A； 70～100 min， 70%A)，流速0.8 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量2 μL。质谱条件为飞行时间质谱采用电喷雾负离子模式：毛细管电压 4.5 kV，喷雾器压力 2.0 bar，干燥气体(N2)流速 4.0 L·min-1，干燥气体温度 180 ℃，funnel 1∶200.0 Vpp， funnel 2∶200.0 Vpp，hexapole Rf 100.0 Vpp，四级杆离子能量 3.0 eV，collision Rf 150.0 Vpp，离子传输时间 80 μs，前脉冲存储时间 5 μs，碰撞气体氩气，碰撞能量 30 eV。质谱测定数据采用全扫描模式采集，数据采集范围m/z 50～1 000。
2.1.2UPLC-QqQ-MS法定量分析色谱条件Waters CORTECS C18 (2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，流动相乙腈(A)-(0.1%甲酸)水(B)，梯度洗脱(0～0.5 min， 8%～10%A； 0.5～2.5 min， 10%～15%A； 2.5～4.5 min， 15%～20%A； 4.5～6.5 min， 20%～40%A；6.5～8.5 min， 10%～10%A)，流速 0.25 mL·min-1，柱温45 ℃，进样量1 μL。质谱条件：电喷雾负离子模式，毛细管电压 2.5 kv，锥孔电压50 v，脱溶剂气流 N2 800 L·h-1，脱溶剂温度 200 ℃，锥孔气流 N2 50 L·h-1，离子源温度 150 ℃，Extractor 3.00 V，碰撞气体氩气。, 百拇医药(许文 傅志勤 林婧 黄学城 陈丹 于虹敏 黄泽豪 范世明)