HPLC同时测定独一味中7种成分含量(1)
[摘要]目的：建立高效液相色谱法同时测定独一味中7种成分含量的方法。方法：采用HPLC，Welchrom C18色谱柱，乙睛-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱系统，体积流量1.0 mL·min-1，检测波长为238， 330， 350 nm，柱温30 ℃。结果：7种成分的分离度良好，标准曲线在线性范围内相关性良好，加样回收率均值为96.47%～102.2%，RSD为0.70%～2.2%。结论：地上部分各成分组间具有较好的相关性，地上部分样品中山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯总量的均值为1.44%。地上部分比地下部分成分种类更多，含量更高，以地上部分入药更合理。所建立方法操作简单，具有较好的重复性和稳定性，可用于独一味药材的鉴别及质量评价。
[关键词]独一味；HPLC；环烯醚萜苷；苯乙醇苷；黄酮；含量测定
独一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo系唇形科独一味属植物，是重要的青藏高原药用植物和常用大宗藏药，为一级濒危藏药品种[1]，《四部医典》和《晶珠本草》中记载本品有强筋骨，干黄水，止痛之功。现代临床用于活血止血、祛风止痛，广泛治疗跌打损伤、风湿痹痛、外科手术后的刀口疼痛、出血等症，对癌症疼痛亦有很好的抑制作用，且无成瘾性，开发前景极为广阔。我国现有生产含独一味及其提取物的现代制剂逾20种，如独一味胶囊、奇正消痛贴等知名品种。独一味药材来源全部依靠野生资源，近年来由于需求量剧增，连年过度采收造成可采资源急剧下降，为了保护日益减少的独一味野生资源，2010年版中国药典将其入药部位由全草修订为地上部分[2]。
, 百拇医药
现代研究表明，独一味的活性成分主要有3类成分：环烯醚萜苷，具有很好的镇痛[3-4]、止血、促凝血作用[5]；苯乙醇苷和黄酮均具有镇痛活性[6-7]。然而，现有关于独一味药材质量控制的报道多为采用HPLC测定其中1～2类成分。如药典标准只测定了独一味地上部分中山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯这2种环烯醚萜苷的含量[2]；潘正[8]等同时测定了独一味根中4种环烯醚萜苷和2种苯乙醇苷；何映霞[9]等同时测定了独一味地上部分中2种苯乙醇苷和2种黄酮。尚未见同时测定独一味中上述3类主成分的报道，因此，本文采用HPLC建立了独一味的多指标含量测定方法，同时测定了2种环烯醚萜苷、2种苯乙醇苷、2种黄酮及1种咖啡酰共7种成分的含量。所建立的方法能弥补现有研究的不足，进一步完善独一味的质量控制标准，为该药材的合理利用提供科学依据。
1材料
, 百拇医药 Utimate 3000高效液相色谱仪(包括四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱，VWD3400紫外检测器，Chromeleon色谱工作站，德国戴安)，Sartorius BS224S电子分析天平(德国赛多利斯)，MILLIQ超纯水机(美国Millipore)。
山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司(供含量测定用，纯度≥98%)。乙腈(色谱纯，Fisher)，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
独一味自采对口药材24批，购买5批，共计29批，见表1，由成都中医药大学古锐副研究员鉴定为独一味L. rotata。
2方法与结果
2.1色谱条件Welchrom C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)- 0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～15 min，12%；15～20 min，12%A～20.5%A；20～30 min，20.5%A)；流速1.0 mL·min-1；柱温 30 ℃；进样量10 μL。山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯检测波长为238 nm；绿原酸、连翘酯苷B和麦角甾苷检测波长为330 nm；芦丁和木犀草苷检测波长为350 nm。按照上述色谱条件进行测定，各成分分离度良好，对照品及样品的色谱图见图1。
, 百拇医药
2.2对照品溶液的制备称取减压干燥至恒重的对照品适量，加入甲醇配制成每1 mL含山栀苷甲酯0.288 mg、绿原酸0.177 mg、8-O-乙酰山栀苷甲酯0.408 mg、连翘酯苷B 0.446 mg、芦丁0.154 mg、麦角甾苷0.512 mg、木犀草苷0.368 mg的混合对照品溶液A。精密吸取混合对照品溶液A 1.0 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，制备稀释后的混合对照品溶液B。
2.3供试品溶液的制备取独一味(中粉)约0.5 g，精密称定，精密加入60%甲醇40 mL，称定质量，回流提取60 min，冷却后补重，摇匀，静置，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4线性关系的考察分别精密吸取混合对照品B溶液4， 8 μL以及混合对照品A溶液2， 4， 8 μL进样，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线，计算得各对照品的回归方程和线性范围(表2)。
2.5精密度试验精密吸取供试品溶液(7-1号)10 μL，连续进样5次，记录色谱峰面积。结果山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷峰面积的RSD分别是0.72%，0.79%，0.82%，1.25%，1.22%，0.92%，0.88%。表明仪器精密度良好。
2.6重复性试验取同一份样品(7-1号)粉末6份，按2.3项下方法平行制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。结果山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷峰面积的RSD分别是1.7%，1.9%，1.5%，2.4%，2.1%，2.6%，2.3%。表明方法的重复性良好。, 百拇医药(钟世红 古锐 王铃鑫 廖艳凤 郑小华 郑欣 曹赟)
[关键词]独一味；HPLC；环烯醚萜苷；苯乙醇苷；黄酮；含量测定
独一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo系唇形科独一味属植物，是重要的青藏高原药用植物和常用大宗藏药，为一级濒危藏药品种[1]，《四部医典》和《晶珠本草》中记载本品有强筋骨，干黄水，止痛之功。现代临床用于活血止血、祛风止痛，广泛治疗跌打损伤、风湿痹痛、外科手术后的刀口疼痛、出血等症，对癌症疼痛亦有很好的抑制作用，且无成瘾性，开发前景极为广阔。我国现有生产含独一味及其提取物的现代制剂逾20种，如独一味胶囊、奇正消痛贴等知名品种。独一味药材来源全部依靠野生资源，近年来由于需求量剧增，连年过度采收造成可采资源急剧下降，为了保护日益减少的独一味野生资源，2010年版中国药典将其入药部位由全草修订为地上部分[2]。
, 百拇医药
现代研究表明，独一味的活性成分主要有3类成分：环烯醚萜苷，具有很好的镇痛[3-4]、止血、促凝血作用[5]；苯乙醇苷和黄酮均具有镇痛活性[6-7]。然而，现有关于独一味药材质量控制的报道多为采用HPLC测定其中1～2类成分。如药典标准只测定了独一味地上部分中山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯这2种环烯醚萜苷的含量[2]；潘正[8]等同时测定了独一味根中4种环烯醚萜苷和2种苯乙醇苷；何映霞[9]等同时测定了独一味地上部分中2种苯乙醇苷和2种黄酮。尚未见同时测定独一味中上述3类主成分的报道，因此，本文采用HPLC建立了独一味的多指标含量测定方法，同时测定了2种环烯醚萜苷、2种苯乙醇苷、2种黄酮及1种咖啡酰共7种成分的含量。所建立的方法能弥补现有研究的不足，进一步完善独一味的质量控制标准，为该药材的合理利用提供科学依据。
1材料
, 百拇医药 Utimate 3000高效液相色谱仪(包括四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱，VWD3400紫外检测器，Chromeleon色谱工作站，德国戴安)，Sartorius BS224S电子分析天平(德国赛多利斯)，MILLIQ超纯水机(美国Millipore)。
山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司(供含量测定用，纯度≥98%)。乙腈(色谱纯，Fisher)，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
独一味自采对口药材24批，购买5批，共计29批，见表1，由成都中医药大学古锐副研究员鉴定为独一味L. rotata。
2方法与结果
2.1色谱条件Welchrom C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)- 0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～15 min，12%；15～20 min，12%A～20.5%A；20～30 min，20.5%A)；流速1.0 mL·min-1；柱温 30 ℃；进样量10 μL。山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯检测波长为238 nm；绿原酸、连翘酯苷B和麦角甾苷检测波长为330 nm；芦丁和木犀草苷检测波长为350 nm。按照上述色谱条件进行测定，各成分分离度良好，对照品及样品的色谱图见图1。
, 百拇医药
2.2对照品溶液的制备称取减压干燥至恒重的对照品适量，加入甲醇配制成每1 mL含山栀苷甲酯0.288 mg、绿原酸0.177 mg、8-O-乙酰山栀苷甲酯0.408 mg、连翘酯苷B 0.446 mg、芦丁0.154 mg、麦角甾苷0.512 mg、木犀草苷0.368 mg的混合对照品溶液A。精密吸取混合对照品溶液A 1.0 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，制备稀释后的混合对照品溶液B。
2.3供试品溶液的制备取独一味(中粉)约0.5 g，精密称定，精密加入60%甲醇40 mL，称定质量，回流提取60 min，冷却后补重，摇匀，静置，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4线性关系的考察分别精密吸取混合对照品B溶液4， 8 μL以及混合对照品A溶液2， 4， 8 μL进样，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线，计算得各对照品的回归方程和线性范围(表2)。
2.5精密度试验精密吸取供试品溶液(7-1号)10 μL，连续进样5次，记录色谱峰面积。结果山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷峰面积的RSD分别是0.72%，0.79%，0.82%，1.25%，1.22%，0.92%，0.88%。表明仪器精密度良好。
2.6重复性试验取同一份样品(7-1号)粉末6份，按2.3项下方法平行制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。结果山栀苷甲酯、绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、芦丁、麦角甾苷、木犀草苷峰面积的RSD分别是1.7%，1.9%，1.5%，2.4%，2.1%，2.6%，2.3%。表明方法的重复性良好。, 百拇医药(钟世红 古锐 王铃鑫 廖艳凤 郑小华 郑欣 曹赟)