中药生物药剂学分类系统中多成分环境对葛根素渗透性的影响(1)
[摘要] 中药生物药剂学分类系统(biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS)中的渗透性评价，需多成分作为整体来开展研究，即使在研究具体某一成分时，也应将其放在多成分环境中审视。该实验以此为原则，将葛根芩连汤中的高含量成分作为多成分环境影响因素，考察葛根素的肠渗透性，运用在体肠单向灌流模型，对葛根素肠渗透性的相关参数进行测定，评价其他高含量成分对其肠渗透性的影响。实验结果表明不同比例的黄芩苷、甘草酸和小檗碱对葛根素的肠渗透性均有一定的影响，甘草酸能显著抑制葛根素的肠吸收，高浓度小檗碱会促进葛根素的吸收。该研究结果表明中药生物药剂学分类系统的渗透性评价充分考虑多成分环境中其他成分的影响是重要的研究思想。
[关键词] 葛根素;多成分环境;在体肠单向灌流;肠渗透性
[收稿日期] 2014-07-18
, http://www.100md.com [基金项目] 国家自然科学基金项目(81473362)
[通信作者] *董玲，副研究员，硕士生导师，主要从事新剂型给药系统研究，Tel：(010)64286245，E-mail：dongling@bucm.edu.cn
[作者简介] 刘洋，副教授，硕士生导师，主要从事药物代谢研究，Tel：(010)84738629，E-mail：liuyang@bucm.edu.cn
中药无论是单味药还是复方，均含有众多化学成分，多成分是中药制剂临床使用的基本特征[1]。多数中药的临床作用是多成分被口服吸收后显现的，中药内含的某单一成分都处于受其他成分影响的多成分环境中，其吸收必定受到多成分环境的影响[2]。目前文献中报道的中药单体成分渗透性研究较为多见[3]，但以多成分为整体，研究某一成分渗透性时，充分考虑其他多成分影响的研究仍旧少见。而中药生物药剂学分类系统中用于分类的渗透性评价就应客观地在多成分环境中考察。目前美国FDA、欧盟EMA乃至中国CFDA，对多成分环境中单一成分的渗透性评价皆无规定。所以，本研究的目的是探索多成分环境对成分肠渗透性的影响，丰富CMMBCS的同时，也为药品管理部门提供参考。
, 百拇医药
化学成分的渗透性研究可采用体外Caco-2细胞模型[4]、间接体内尤金池实验[5]、人体[6]及动物在体肠灌流等技术开展。鉴于鼠小肠吸收与人类小肠吸收的相似性，及鼠小肠吸收模型所得的数据与人类小肠吸收的良好相关性[7-8]，本实验采用大鼠进行实验。并通过课题组前期的系统实验方法分析[9]，结合FDA已认可大鼠小肠单向灌流实验作为BCS中渗透性分类[10]依据的现实，故本研究渗透性实验中采用大鼠在体肠单向灌流技术实施。
1 材料
1.1 仪器
Waters液相色谱系统(600四元泵，美国Waters公司)，2487双波长紫外检测器，Empower2工作站;BT-25S电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司);BT100-1F注射泵(保定兰格恒流泵有限公司)。
1.2 药物与试剂
, http://www.100md.com
葛根素对照品(批号110752-200912，中国食品药品检定研究院);葛根素原料(批号120504，陕西中鑫生物技术有限公司);黄芩苷原料(批号ZL-A-018，南京泽朗医药科技有限公司);盐酸小檗碱原料(批号120212，陕西中鑫生物技术有限公司);甘草酸单铵原料(批号GU20120611，武汉金诺化工有限公司)。乙腈(色谱纯，美国Fisher)，娃哈哈纯净水购买于娃哈哈集团公司(中国杭州)，其他试剂均为分析纯。Krebs-Ringer′s营养液(K-R液)：称取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g，加去离子水定容至1 000 mL，即得。
1.3 动物
Wistar大鼠，雄性，体重200～250 g，北京维通利华试验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXK(京)2012-0001。
, 百拇医药
2 方法
2.1 溶液的配制
2.1.1 对照品溶液制备 精密称取葛根素对照品10 mg，置10 mL量瓶中加入不同的溶出介质适量，置超声仪中使完全溶解，加溶出介质至刻度，摇匀，制成质量浓度约为1.0 g·L-1的对照品储备液。
2.1.2 空白肠灌流液的制备 K-R液适量，按2.3项下方法灌流，收集流出液，即得。
2.1.3 含药肠灌流液的制备 称取葛根素原料药200 mg，和不同比例的方中其他成分，加入10 mL pH 7.4的缓冲液于25 mL具塞试管中，按2010年版药典凡例下溶解度的操作，每隔5 min强力振摇30 s;过滤后取续滤液用K-R液稀释得葛根素质量浓度为80 mg·L-1的灌流液。
2.2 分析方法的建立
, http://www.100md.com
2.2.1 色谱条件 Luna C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm，Phenomenex，USA);流速1.0 mL·min-1;检测波长250 nm;柱温30 ℃;进样量20 μL;流动相：0.05%磷酸溶液-乙腈(82∶18)。
2.2.2 标准曲线绘制 精密移取2.1.1项对照品储备液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，定容至5 mL得质量浓度为20，40，80，120，160，200 mg·L-1的系列对照品溶液，分别精密吸取各系列对照品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归得其标准曲线y=113 923x-535 665，R2= 0.999 1。
2.2.3 精密度试验 取对照品灌流液于1 d内HPLC重复测定6次考察日内精密度;取对照品灌流液，分别于第1，3，5天HPLC测定，考察日间精密度。日内精密度及日间精密度RSD均小于4%。, http://www.100md.com(刘洋 王刚 董玲 唐明敏 朱美玲 董红环 侯成波)
[关键词] 葛根素;多成分环境;在体肠单向灌流;肠渗透性
[收稿日期] 2014-07-18
, http://www.100md.com [基金项目] 国家自然科学基金项目(81473362)
[通信作者] *董玲，副研究员，硕士生导师，主要从事新剂型给药系统研究，Tel：(010)64286245，E-mail：dongling@bucm.edu.cn
[作者简介] 刘洋，副教授，硕士生导师，主要从事药物代谢研究，Tel：(010)84738629，E-mail：liuyang@bucm.edu.cn
中药无论是单味药还是复方，均含有众多化学成分，多成分是中药制剂临床使用的基本特征[1]。多数中药的临床作用是多成分被口服吸收后显现的，中药内含的某单一成分都处于受其他成分影响的多成分环境中，其吸收必定受到多成分环境的影响[2]。目前文献中报道的中药单体成分渗透性研究较为多见[3]，但以多成分为整体，研究某一成分渗透性时，充分考虑其他多成分影响的研究仍旧少见。而中药生物药剂学分类系统中用于分类的渗透性评价就应客观地在多成分环境中考察。目前美国FDA、欧盟EMA乃至中国CFDA，对多成分环境中单一成分的渗透性评价皆无规定。所以，本研究的目的是探索多成分环境对成分肠渗透性的影响，丰富CMMBCS的同时，也为药品管理部门提供参考。
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化学成分的渗透性研究可采用体外Caco-2细胞模型[4]、间接体内尤金池实验[5]、人体[6]及动物在体肠灌流等技术开展。鉴于鼠小肠吸收与人类小肠吸收的相似性，及鼠小肠吸收模型所得的数据与人类小肠吸收的良好相关性[7-8]，本实验采用大鼠进行实验。并通过课题组前期的系统实验方法分析[9]，结合FDA已认可大鼠小肠单向灌流实验作为BCS中渗透性分类[10]依据的现实，故本研究渗透性实验中采用大鼠在体肠单向灌流技术实施。
1 材料
1.1 仪器
Waters液相色谱系统(600四元泵，美国Waters公司)，2487双波长紫外检测器，Empower2工作站;BT-25S电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司);BT100-1F注射泵(保定兰格恒流泵有限公司)。
1.2 药物与试剂
, http://www.100md.com
葛根素对照品(批号110752-200912，中国食品药品检定研究院);葛根素原料(批号120504，陕西中鑫生物技术有限公司);黄芩苷原料(批号ZL-A-018，南京泽朗医药科技有限公司);盐酸小檗碱原料(批号120212，陕西中鑫生物技术有限公司);甘草酸单铵原料(批号GU20120611，武汉金诺化工有限公司)。乙腈(色谱纯，美国Fisher)，娃哈哈纯净水购买于娃哈哈集团公司(中国杭州)，其他试剂均为分析纯。Krebs-Ringer′s营养液(K-R液)：称取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g，加去离子水定容至1 000 mL，即得。
1.3 动物
Wistar大鼠，雄性，体重200～250 g，北京维通利华试验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXK(京)2012-0001。
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2 方法
2.1 溶液的配制
2.1.1 对照品溶液制备 精密称取葛根素对照品10 mg，置10 mL量瓶中加入不同的溶出介质适量，置超声仪中使完全溶解，加溶出介质至刻度，摇匀，制成质量浓度约为1.0 g·L-1的对照品储备液。
2.1.2 空白肠灌流液的制备 K-R液适量，按2.3项下方法灌流，收集流出液，即得。
2.1.3 含药肠灌流液的制备 称取葛根素原料药200 mg，和不同比例的方中其他成分，加入10 mL pH 7.4的缓冲液于25 mL具塞试管中，按2010年版药典凡例下溶解度的操作，每隔5 min强力振摇30 s;过滤后取续滤液用K-R液稀释得葛根素质量浓度为80 mg·L-1的灌流液。
2.2 分析方法的建立
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2.2.1 色谱条件 Luna C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm，Phenomenex，USA);流速1.0 mL·min-1;检测波长250 nm;柱温30 ℃;进样量20 μL;流动相：0.05%磷酸溶液-乙腈(82∶18)。
2.2.2 标准曲线绘制 精密移取2.1.1项对照品储备液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，定容至5 mL得质量浓度为20，40，80，120，160，200 mg·L-1的系列对照品溶液，分别精密吸取各系列对照品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归得其标准曲线y=113 923x-535 665，R2= 0.999 1。
2.2.3 精密度试验 取对照品灌流液于1 d内HPLC重复测定6次考察日内精密度;取对照品灌流液，分别于第1，3，5天HPLC测定，考察日间精密度。日内精密度及日间精密度RSD均小于4%。, http://www.100md.com(刘洋 王刚 董玲 唐明敏 朱美玲 董红环 侯成波)