白头翁皂苷影响RA模型大鼠FLS MeCP2表达(1)
[摘要] 研究中药白头翁主要活性成分白头翁皂苷(PULC)对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis， RA)模型大鼠MeCP2表达的调控作用。采用佐剂性关节炎大鼠为RA模型，原代培养RA模型大鼠滑膜成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)，Real time qPCR， Western blotting检测100 mg·kg-1PULC灌胃治疗对RA模型大鼠FLS MeCP2表达的调控作用，MTT检测PULC治疗对FLS增殖的影响，MeCP2 siRNA干扰RA模型大鼠FLS MeCP2表达后SFRP2，β-catenin表达的变化。检测发现经100 mg·kg-1PULC灌胃治疗后，RA模型大鼠FLS中MeCP2表达明显降低，SFRP2表达升高，RA模型大鼠FLS增殖活力降低，MeCP2 siRNA抑制RA模型大鼠FLS MeCP2表达后，SFRP2表达明显上调，β-catenin表达明显降低。PULC可能通过抑制MeCP2表达上调SFRP2表达，抑制RA模型大鼠滑膜Wnt通路活性，抑制RA模型大鼠滑膜异常增殖。
, http://www.100md.com [关键词] 白头翁皂苷; 类风湿性关节炎; MeCP2; SFRP2; Wnt
[收稿日期] 2014-04-12
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81302783);安徽省高校振兴计划人才项目(098);安徽省质量工程项目(2013zy057);滁州市科技局科研项目(201306);安徽省教育厅科研项目(KJ2012Z069);安徽科技学院第十一批校大学生创新课题(14XSF162，14XSZ164)
[通信作者] *缪成贵，博士，研究方向为抗炎免疫药理学，E-mail：miaocgastu@126.com
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis， RA)是一种多关节性、系统性免疫疾病，世界范围发病率0.5%～1.0%，我国发病率约为0.5%[1-2]。发病机制目前仍不清楚，成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)在RA病理变化中发挥重要作用[3-4]。Wnt通路的激活促进RA的发生发展，在RA病理中Wnt信号通路关键基因β-catenin和C-myc基因表达明显升高[5-6]。本课题组前期研究发现RA模型大鼠FLS中SFRP2基因表达明显下调，经100 mg·kg-1白头翁皂苷(pulchinenoside，PULC)灌胃治疗后，RA模型大鼠FLS中Wnt信号通路上游负调控因子SFRP2表达上调，Wnt信号通路关键基因β-catenin和C-myc基因表达明显下调，PULC通过对Wnt通路的调控抑制RA模型大鼠滑膜异常增殖[7]。DNA甲基化结合蛋白MeCP2能够甲基化修饰靶基因，导致靶基因表达下调，为进一步探讨RA模型大鼠中SFRP2基因表达降低的原因及MeCP2的作用，本文采用Real time qPCR， Western blotting等方法研究MeCP2在RA大鼠和对照大鼠中的表达差异，采用MeCP2 siRNA转染等方法研究MeCP2表达抑制对SFRP2表达的影响，研究100 mg·kg-1PULC灌胃治疗对RA模型大鼠FLS中MeCP2表达的影响，对RA模型大鼠FLS增殖的影响，探讨MeCP2在RA病理中的重要作用，为RA疾病防治提供新的思路。
, 百拇医药
1 材料
Applied Biosystems Gene Amp StepOneTM Real-Time qPCR System(美国ABI公司);电泳仪(Bio-rad);半干转膜仪(Bio-rad);倒置显微镜(奥林巴斯);ChemiScope3400 Mini化学发光成像(上海勤翔科学仪器有限公司);倒置荧光显微镜(奥林巴斯);101AS-3型数显恒温干燥箱(上海浦东跃欣科学仪器厂);CO2培养箱(Thermo);超净工作台(江苏净化仪器设备有限公司)。
白头翁皂苷(上海一林生物科技有限公司);逆转录试剂盒(Fermentas);QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen公司);MeCP2抗体(Santa);SFRP2抗体(Anbo);Western裂解液(上海碧云天生物技术有限公司);MeCP2，SFRP2定量PCR引物(上海生工)。
2 方法
, http://www.100md.com
2.1 RA模型大鼠 SD雄性大鼠，体重180～200 g，安徽医科大学实验动物中心提供(合格证号皖医动准01号)，随机分为3组：正常组、模型组、白头翁皂苷100 mg·kg-1，每组10只。模型组以福氏完全佐剂于每只大鼠右后足趾皮内注射0.1 mL致炎，正常对照组注射0.1 mL PBS。
2.2 大鼠滑膜FLS原代培养 致炎后第28天股动脉放血处死大鼠，分离大鼠双侧膝关节滑膜组织，用无Ca2+，Mg2+的D-Hanks液反复漂洗3次后剪成约1～2 mm3小块。用弯头吸管吸取数小块均匀排列在培养瓶中的底壁上，瓶底朝上置37 ℃，5%CO2培养箱内培养7 h后翻正培养。待滑膜FLS长出组织块成团块状后弃除组织块，继续培养至细胞覆盖瓶底90%，胰蛋白酶消化细胞传代培养。实验用细胞为传代3～5次FLS。
2.3 MTT检测FLS增殖活性 用含15%小牛血清 的DMEM培养液制备FLS悬液(4×108个/L)，96孔培养板中每孔加100 μL， 37 ℃，5%CO2培养24 h。贴壁后更换培养液100 μL，继续培养72 h后，每孔加5 g·L-1MTT 10 μL。继续培养4 h，吸弃上清液，加入二甲基亚砜100 μL，振荡30 s，酶标仪检测，结果以3个复孔的均值表示。
2.4 Real time qPCR检测MeCP2，SFRP2基因表达 Trizol法提取细胞总RNA，逆转录酶逆转录得到cDNA。定量PCR引物由上海生工合成。定量PCR扩增反应条件为：94 ℃，15 s;60 ℃，30 s;72 ℃，30 s。共40个循环。定量PCR引物序列见表1，MeCP2 siRNA序列见表2。, 百拇医药(缪成贵 周国梁 秦梅颂 陈建中 李成凤 何华奇)
, http://www.100md.com [关键词] 白头翁皂苷; 类风湿性关节炎; MeCP2; SFRP2; Wnt
[收稿日期] 2014-04-12
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81302783);安徽省高校振兴计划人才项目(098);安徽省质量工程项目(2013zy057);滁州市科技局科研项目(201306);安徽省教育厅科研项目(KJ2012Z069);安徽科技学院第十一批校大学生创新课题(14XSF162，14XSZ164)
[通信作者] *缪成贵，博士，研究方向为抗炎免疫药理学，E-mail：miaocgastu@126.com
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis， RA)是一种多关节性、系统性免疫疾病，世界范围发病率0.5%～1.0%，我国发病率约为0.5%[1-2]。发病机制目前仍不清楚，成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)在RA病理变化中发挥重要作用[3-4]。Wnt通路的激活促进RA的发生发展，在RA病理中Wnt信号通路关键基因β-catenin和C-myc基因表达明显升高[5-6]。本课题组前期研究发现RA模型大鼠FLS中SFRP2基因表达明显下调，经100 mg·kg-1白头翁皂苷(pulchinenoside，PULC)灌胃治疗后，RA模型大鼠FLS中Wnt信号通路上游负调控因子SFRP2表达上调，Wnt信号通路关键基因β-catenin和C-myc基因表达明显下调，PULC通过对Wnt通路的调控抑制RA模型大鼠滑膜异常增殖[7]。DNA甲基化结合蛋白MeCP2能够甲基化修饰靶基因，导致靶基因表达下调，为进一步探讨RA模型大鼠中SFRP2基因表达降低的原因及MeCP2的作用，本文采用Real time qPCR， Western blotting等方法研究MeCP2在RA大鼠和对照大鼠中的表达差异，采用MeCP2 siRNA转染等方法研究MeCP2表达抑制对SFRP2表达的影响，研究100 mg·kg-1PULC灌胃治疗对RA模型大鼠FLS中MeCP2表达的影响，对RA模型大鼠FLS增殖的影响，探讨MeCP2在RA病理中的重要作用，为RA疾病防治提供新的思路。
, 百拇医药
1 材料
Applied Biosystems Gene Amp StepOneTM Real-Time qPCR System(美国ABI公司);电泳仪(Bio-rad);半干转膜仪(Bio-rad);倒置显微镜(奥林巴斯);ChemiScope3400 Mini化学发光成像(上海勤翔科学仪器有限公司);倒置荧光显微镜(奥林巴斯);101AS-3型数显恒温干燥箱(上海浦东跃欣科学仪器厂);CO2培养箱(Thermo);超净工作台(江苏净化仪器设备有限公司)。
白头翁皂苷(上海一林生物科技有限公司);逆转录试剂盒(Fermentas);QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen公司);MeCP2抗体(Santa);SFRP2抗体(Anbo);Western裂解液(上海碧云天生物技术有限公司);MeCP2，SFRP2定量PCR引物(上海生工)。
2 方法
, http://www.100md.com
2.1 RA模型大鼠 SD雄性大鼠，体重180～200 g，安徽医科大学实验动物中心提供(合格证号皖医动准01号)，随机分为3组：正常组、模型组、白头翁皂苷100 mg·kg-1，每组10只。模型组以福氏完全佐剂于每只大鼠右后足趾皮内注射0.1 mL致炎，正常对照组注射0.1 mL PBS。
2.2 大鼠滑膜FLS原代培养 致炎后第28天股动脉放血处死大鼠，分离大鼠双侧膝关节滑膜组织，用无Ca2+，Mg2+的D-Hanks液反复漂洗3次后剪成约1～2 mm3小块。用弯头吸管吸取数小块均匀排列在培养瓶中的底壁上，瓶底朝上置37 ℃，5%CO2培养箱内培养7 h后翻正培养。待滑膜FLS长出组织块成团块状后弃除组织块，继续培养至细胞覆盖瓶底90%，胰蛋白酶消化细胞传代培养。实验用细胞为传代3～5次FLS。
2.3 MTT检测FLS增殖活性 用含15%小牛血清 的DMEM培养液制备FLS悬液(4×108个/L)，96孔培养板中每孔加100 μL， 37 ℃，5%CO2培养24 h。贴壁后更换培养液100 μL，继续培养72 h后，每孔加5 g·L-1MTT 10 μL。继续培养4 h，吸弃上清液，加入二甲基亚砜100 μL，振荡30 s，酶标仪检测，结果以3个复孔的均值表示。
2.4 Real time qPCR检测MeCP2，SFRP2基因表达 Trizol法提取细胞总RNA，逆转录酶逆转录得到cDNA。定量PCR引物由上海生工合成。定量PCR扩增反应条件为：94 ℃，15 s;60 ℃，30 s;72 ℃，30 s。共40个循环。定量PCR引物序列见表1，MeCP2 siRNA序列见表2。, 百拇医药(缪成贵 周国梁 秦梅颂 陈建中 李成凤 何华奇)