毛蕊异黄酮葡萄糖苷对升麻素苷及其苷元大鼠体内药代动力学特征的影响研究(1)
[摘要] 为了探索黄芪-防风配伍用药的科学内涵，实验建立了利用 UPLC-MS/MS 同时测定大鼠血浆中升麻素苷、升麻素的分析方法，研究黄芪中主要活性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷对防风中主要活性成分升麻素苷及其苷元大鼠体内药代动力学特征的影响。取雄性SD大鼠分为2组，每组6只，分别灌胃给药升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷-升麻素苷，于不同时间点眼眶取血，采用UPLC-MS/MS方法，检测血浆中升麻素苷及其苷元升麻素的含量，使用DAS3.2.4 软件处理数据并分析。该实验建立的UPLC-MS/MS方法快速、准确和灵敏，可用于大鼠血浆中升麻素苷、升麻素的同时测定，色谱柱为BEHC18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流动相为乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱，流速为0.3 mL·min-1，采用电喷雾电离源(ESI)，多反应离子监测(MRM)扫描方式。结果表明，与升麻素苷组相比，毛蕊异黄酮葡萄糖苷-升麻素苷组中升麻素苷的AUC0-t，AUC0-∞显著性提高(P<0.05)，升麻素的Cmax显著性提高(P<0.05)。结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷能促进升麻素苷及其苷元的吸收，增加生物利用度，初步说明了黄芪-防风配伍用药的合理性。
, 百拇医药
[关键词] 升麻素苷;升麻素;毛蕊异黄酮葡萄糖苷;药代动力学
[收稿日期] 2014-07-17
[基金项目] 国家自然科学基金青年基金项目(81102825)
[通信作者] *赵晓莉，副研究员，博士，硕士生导师，研究方向为中药新剂型新技术应用与评价研究，Tel：(025)85811230，E-mail：xlee_zhao@163.com
《本草衍义》云：“黄芪、防风，世多相须而用”。黄芪作为传统的补益类中药，具有补气升阳、益卫固表、利水退肿之功;防风具有解表散风、胜湿止痛、祛风止痉之效。二者配伍可驱邪扶正，在治疗虚人外感、表虚自汗等多种病症中均有良好疗效，历代医著方剂中对黄芪、防风的配伍使用均有记载[1-3]，现代调查研究表明，黄芪、防风在中医临床配伍使用的频率仍较高[4-5]。现代药效学实验研究表明黄芪、防风配伍后，在增强免疫、抗氧化等生物效应上具有显著的协同增效作用[6-7]。以升麻素苷、升麻素等为代表的色原酮类成分，是防风发挥药效作用的主要物质基础[8]，且升麻素苷在体内极易转化为其苷元升麻素[9]。毛蕊异黄酮葡萄糖苷及其苷元是黄芪中主要的黄酮类活性成分。本课题组在前期进行了黄芪、防风饮片配伍前后药代动学力学参数的比较研究，结果提示药对配伍后两药的主要活性成分的药代动力学参数发生明显变化，各自的生物利用度有所提高。本实验选取前期实验中药代动力学特征变化显著的升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷为研究对象，通过大鼠口服升麻素苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷配伍升麻素苷后升麻素苷及其苷元升麻素血药浓度-时间曲线及其药动学参数的比较分析，进一步揭示黄芪-防风配伍的科学内涵。
, 百拇医药
1 材料
1.1 药材、对照品和试剂
橙皮苷对照品(批号110721-201115)、升麻素苷对照品(批号111522-201008)、升麻素对照品(批号111710-200501)均购于中国食品药品检定研究院;毛蕊异黄酮葡萄糖苷原料药(批号20120425， 纯度为98%)购于上海源叶生物科技有限公司， 升麻素苷原料药(纯度为98%)(南京泽郎医药科技有限公司);甲醇(色谱纯，德国Merck公司)、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)，其余溶剂均为分析纯，水为密理博超纯水仪制备的超纯水。
1.2 动物
清洁级SD大鼠，全雄，体重220～250 g。合格证号SCXK(苏)2008-5033。
1.3 仪器
, http://www.100md.com
超高效液相色谱-TQD质谱联用仪(ACQUITY系统，美国Waters公司) ，MassLynx V4.1工作站。BP211D型电子分析天平(德国Sartorius公司)，MicroCL 21R微量离心机(美国赛默飞世尔科技公司)，微量移液器(德国Eppendorf公司)，Vortex-Genie 2涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司)，DCY-24G 可调式浓缩仪(青岛海科仪器有限公司)，默克密理博Synergy超纯水仪(德国Merck公司)。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
2.1.1 系列浓度对照品溶液的配制 分别取干燥至恒重的升麻素苷、升麻素对照品适量，精密称定，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得升麻素苷、升麻素质量浓度分别为9.6，384 mg·L-1的混合对照品储备液，密封后置4 ℃冰箱冷藏，待用时用甲醇稀释升麻素苷、升麻素至0.48，19.2 mg·L-1，作为标准曲线的第1个点，再逐倍稀释成系列浓度的混合对照品溶液。
, 百拇医药
2.1.2 内标溶液的配制 取干燥至恒重的橙皮苷对照品适量，精密称定，加入甲醇溶解并定容至刻度，制得质量浓度为120 mg·L-1的内标储备液，密封后置4 ℃冰箱冷藏，待用时用甲醇稀释至所需浓度。
2.2 原料药溶液的制备
分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素苷原料药，以0.5% CMC-Na为溶剂溶解，制得升麻素苷(质量浓度为8 g·L-1)溶液及毛蕊异黄酮葡萄糖苷(质量浓度为2 g·L-1)-升麻素苷(质量浓度为8 g·L-1)溶液。
2.3 给药方案及血浆样品处理方法
2.3.1 给药方案 取雄性SD大鼠，分为2组，每组6只。给药前禁食12 h，期间自由饮水。灌胃给药，一组给予升麻素苷(80 mg·kg-1)，另一组给予毛蕊异黄酮葡萄糖苷(20 mg·kg-1)- 升麻素苷(80 mg·kg-1)。分别于2，5，10，20，30，60，90，120，180，240，360，720，1 440 min眼底静脉丛取血 0.3 mL，加入到含有肝素钠的离心管中，离心(5 000 r·min-1，6 min)，分离血浆，取上清，冻存于-20 ℃冰箱，备用。, 百拇医药(赵晓莉 刘玲 狄留庆 李俊松 康安)
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[关键词] 升麻素苷;升麻素;毛蕊异黄酮葡萄糖苷;药代动力学
[收稿日期] 2014-07-17
[基金项目] 国家自然科学基金青年基金项目(81102825)
[通信作者] *赵晓莉，副研究员，博士，硕士生导师，研究方向为中药新剂型新技术应用与评价研究，Tel：(025)85811230，E-mail：xlee_zhao@163.com
《本草衍义》云：“黄芪、防风，世多相须而用”。黄芪作为传统的补益类中药，具有补气升阳、益卫固表、利水退肿之功;防风具有解表散风、胜湿止痛、祛风止痉之效。二者配伍可驱邪扶正，在治疗虚人外感、表虚自汗等多种病症中均有良好疗效，历代医著方剂中对黄芪、防风的配伍使用均有记载[1-3]，现代调查研究表明，黄芪、防风在中医临床配伍使用的频率仍较高[4-5]。现代药效学实验研究表明黄芪、防风配伍后，在增强免疫、抗氧化等生物效应上具有显著的协同增效作用[6-7]。以升麻素苷、升麻素等为代表的色原酮类成分，是防风发挥药效作用的主要物质基础[8]，且升麻素苷在体内极易转化为其苷元升麻素[9]。毛蕊异黄酮葡萄糖苷及其苷元是黄芪中主要的黄酮类活性成分。本课题组在前期进行了黄芪、防风饮片配伍前后药代动学力学参数的比较研究，结果提示药对配伍后两药的主要活性成分的药代动力学参数发生明显变化，各自的生物利用度有所提高。本实验选取前期实验中药代动力学特征变化显著的升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷为研究对象，通过大鼠口服升麻素苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷配伍升麻素苷后升麻素苷及其苷元升麻素血药浓度-时间曲线及其药动学参数的比较分析，进一步揭示黄芪-防风配伍的科学内涵。
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1 材料
1.1 药材、对照品和试剂
橙皮苷对照品(批号110721-201115)、升麻素苷对照品(批号111522-201008)、升麻素对照品(批号111710-200501)均购于中国食品药品检定研究院;毛蕊异黄酮葡萄糖苷原料药(批号20120425， 纯度为98%)购于上海源叶生物科技有限公司， 升麻素苷原料药(纯度为98%)(南京泽郎医药科技有限公司);甲醇(色谱纯，德国Merck公司)、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)，其余溶剂均为分析纯，水为密理博超纯水仪制备的超纯水。
1.2 动物
清洁级SD大鼠，全雄，体重220～250 g。合格证号SCXK(苏)2008-5033。
1.3 仪器
, http://www.100md.com
超高效液相色谱-TQD质谱联用仪(ACQUITY系统，美国Waters公司) ，MassLynx V4.1工作站。BP211D型电子分析天平(德国Sartorius公司)，MicroCL 21R微量离心机(美国赛默飞世尔科技公司)，微量移液器(德国Eppendorf公司)，Vortex-Genie 2涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司)，DCY-24G 可调式浓缩仪(青岛海科仪器有限公司)，默克密理博Synergy超纯水仪(德国Merck公司)。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
2.1.1 系列浓度对照品溶液的配制 分别取干燥至恒重的升麻素苷、升麻素对照品适量，精密称定，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得升麻素苷、升麻素质量浓度分别为9.6，384 mg·L-1的混合对照品储备液，密封后置4 ℃冰箱冷藏，待用时用甲醇稀释升麻素苷、升麻素至0.48，19.2 mg·L-1，作为标准曲线的第1个点，再逐倍稀释成系列浓度的混合对照品溶液。
, 百拇医药
2.1.2 内标溶液的配制 取干燥至恒重的橙皮苷对照品适量，精密称定，加入甲醇溶解并定容至刻度，制得质量浓度为120 mg·L-1的内标储备液，密封后置4 ℃冰箱冷藏，待用时用甲醇稀释至所需浓度。
2.2 原料药溶液的制备
分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素苷原料药，以0.5% CMC-Na为溶剂溶解，制得升麻素苷(质量浓度为8 g·L-1)溶液及毛蕊异黄酮葡萄糖苷(质量浓度为2 g·L-1)-升麻素苷(质量浓度为8 g·L-1)溶液。
2.3 给药方案及血浆样品处理方法
2.3.1 给药方案 取雄性SD大鼠，分为2组，每组6只。给药前禁食12 h，期间自由饮水。灌胃给药，一组给予升麻素苷(80 mg·kg-1)，另一组给予毛蕊异黄酮葡萄糖苷(20 mg·kg-1)- 升麻素苷(80 mg·kg-1)。分别于2，5，10，20，30，60，90，120，180，240，360，720，1 440 min眼底静脉丛取血 0.3 mL，加入到含有肝素钠的离心管中，离心(5 000 r·min-1，6 min)，分离血浆，取上清，冻存于-20 ℃冰箱，备用。, 百拇医药(赵晓莉 刘玲 狄留庆 李俊松 康安)