1.4 PCR纯化产物的限制性酶切

    纯化后的PCR产物分别用HinfI，HaeⅢ(TaKaRa)进行酶切，反应体系20 μL，37 ℃消化4 h，具体操作按照产品说明书进行。酶切产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序分析。

    1.5 数据处理

    TRFs的长度在29～677 bp且每个峰的荧光高度≥50，用峰面积≥组面积和的0.005倍的数据来进行分析。然后通过网站(http：//mica.ibest.uidaho.edu/trflp.php)检索每个TRF片段可能代表的微生物类群。利用Spade软件计算样品中辛普森(Simpson)多样性指数[17-18]。

    2 结果与分析

    统计发现，正常轮作组，施用自制有机肥组以及市售菌肥组的杭白菊植株存苗率均为100%，而连作对照组杭白菊存苗率仅有26%，鲜花产量只有轮作的1/5。说明有机肥、菌肥和轮作处理均对杭白菊的连作障碍现象具有较好的调控作用，连作障碍基本被克服。

    2.1 限制性内切酶的选择

    在T-RFLP技术分析中，通常根据酶切产生的TRFs数来判断酶切效果的好坏 ......