蒸制和烘制对附子生物碱成分含量的影响研究(1)
[摘要] 研究蒸制和烘制对附子生物碱含量的影响，采用UPLC-MS/MS方法，多反应监测模式(MRM)同时测定附子中13种生物碱成分的含量。结果表明蒸制过程中附子双酯型生物碱含量迅速降低，单酯型生物碱含量先升后降，于40 min时达到最高峰，原碱中乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱快速增加，附子灵、宋果灵、多根乌头碱和去甲猪毛菜碱含量相对稳定或略有降低。烘制过程中生物碱成分的动态变化趋势与蒸制过程有明显差异，双酯型生物碱降解速度比蒸制稍慢，单酯型生物碱、原碱和总生物碱被不同程度破坏，含量显著低于同时间点蒸制附片。该研究揭示了附子蒸制或烘制过程中生物碱成分的动态变化规律，2种炮制方法均能有效去除毒性成分并保留有效成分，工艺简便易行，方法可控，具有推广和应用价值。
[关键词] 附子;生物碱;UPLC-MS/MS;炮制;变化规律
[收稿日期] 2014-05-28
[基金项目] 国家重点基础研究发展计划(973)项目(2009CB522804);国家科技支撑计划项目(2011BAI13B05)
, http://www.100md.com
[通信作者] 易进海，研究员，研究方向为中药化学成分与质量评价，Tel：(028)85210843，E-mail：yijinhai63@163.com
[作者简介] 杨昌林，研究实习员， E-mail：jilang8351@sina.com
附子来源于毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效，其“补火助阳之要药”地位被历代医家推崇。现代研究表明附子主要毒/效成分为生物碱，包括双酯型生物碱、单酯型生物碱、原碱等[1-2]，其中，双酯型生物碱为附子剧毒性成分，单酯型生物碱具有镇痛和抗炎等作用[3-4]，附子灵和宋果灵具有镇痛、降压作用[5]，次乌头原碱、新乌头原碱等原碱和去甲猪毛菜碱均有强心作用[6-7]。附子炮制可使双酯型生物碱水解转化为单酯型生物碱及原碱，减毒存效，其方法囊括炮、炒、煨、蒸、煮等数十种，2010年版《中国药典》收载的黑顺片、白附片、淡附片和炮附片，即是附子经过胆巴水浸制、煮、漂、蒸、晒等工艺加工炮制而成，然法定方法过程繁杂，可控性差，不同批次制附片中生物碱成分含量相差可高达10倍，有效成分流失严重，存在炮制过度之嫌[8-11]，且漂洗不彻底还可导致CaCl2，MgCl2等无机杂质的残留[12]。目前，已有文献报道了蒸制和烘制对附子6种酯型生物碱含量的影响[13]，本文进一步探讨附子直接蒸制或烘制方法的可行性，采用UPLC-MS/MS检测技术，研究13种主要生物碱成分的动态变化规律，以期为附子炮制提供简便可行的加工方法。
, 百拇医药
1 材料
Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Agilent 6460型三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司)，Agilent Masshunter B.03.01 SP2工作站软件(美国Agilent公司)，KQ-100超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，TDL80-2B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，SYQ-DSX-280不锈钢压力蒸气灭菌器(上海申安医疗器械厂)，DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，AUW220D型1/10万天平(日本岛津公司)，Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)。
实验药材购于四川江油中坝附子科技发展有限公司，由四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定，为乌头A. carmichaelii Debx.子根的加工品。氢溴酸高乌甲素(lannaconitine，批号100289-200902)，苯甲酰次乌头原碱(benzoylhypaconine，批号111796-201002)，苯甲酰新乌头原碱(benzoylmeaconine，批号111795-200901)，苯甲酰乌头原碱(benzoylaconine，批号111794-200901)，乌头碱(aconitine，批号110720-200410)，新乌头碱(mesaconitine，批号110799-200505)，次乌头碱(hypaconitine，批号110798-201106)对照品购自中国食品药品检定研究院;去甲猪毛菜碱对照品(salsolinol，批号1-LJM-177-1)购自Toronto Research Chemicals Inc;乌头原碱(aconine，批号must-11051501)，宋果灵(songorine，批号must-12090504)，多根乌头碱(karacoline，批号must-13021802)，附子灵(fuziline，批号must-12090810)对照品购自成都曼思特生物科技有限公司;次乌头原碱(hypaconine)，新乌头原碱(mesaconine)对照品由本实验室从制川乌中分得，HPLC峰面积归一化法分析，纯度均≥98.0%;乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
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2 方法与结果
2.1 炮制加工方法与样品制备
湿热蒸制：取生附片6 kg，加适量水润透，分成6等份，置不锈钢压力蒸气灭菌器内，分别于120 ℃蒸10，20，40，60，90，120 min，晒干，即得蒸附片。
干热烘制：取生附片6 kg，分成6等份，置电热恒温鼓风干燥箱内，分别于150 ℃烘10，20，40，60，90，120 min，即得烘附片。
2.2 LC-MS/MS测定附子13种生物碱的含量
2.2.1 测定条件 液相条件：Agilent SB-C18色谱柱(2.1 mm×20 mm，1.8 μm);柱温35 ℃;流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，B相为2 mmol·L-1乙酸铵溶液+0.1%甲酸;流速0.4 mL·min-1;进样量1 μL。梯度洗脱：0～1.5 min，15%～20% A;1.5～5 min，20% ～70% A;5～5.1 min，70% ～100% A;5.1～8 min，100% A。, 百拇医药(杨昌林 黄志芳 张意涵 刘玉红 刘云华 陈燕 易进海)
[关键词] 附子;生物碱;UPLC-MS/MS;炮制;变化规律
[收稿日期] 2014-05-28
[基金项目] 国家重点基础研究发展计划(973)项目(2009CB522804);国家科技支撑计划项目(2011BAI13B05)
, http://www.100md.com
[通信作者] 易进海，研究员，研究方向为中药化学成分与质量评价，Tel：(028)85210843，E-mail：yijinhai63@163.com
[作者简介] 杨昌林，研究实习员， E-mail：jilang8351@sina.com
附子来源于毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效，其“补火助阳之要药”地位被历代医家推崇。现代研究表明附子主要毒/效成分为生物碱，包括双酯型生物碱、单酯型生物碱、原碱等[1-2]，其中，双酯型生物碱为附子剧毒性成分，单酯型生物碱具有镇痛和抗炎等作用[3-4]，附子灵和宋果灵具有镇痛、降压作用[5]，次乌头原碱、新乌头原碱等原碱和去甲猪毛菜碱均有强心作用[6-7]。附子炮制可使双酯型生物碱水解转化为单酯型生物碱及原碱，减毒存效，其方法囊括炮、炒、煨、蒸、煮等数十种，2010年版《中国药典》收载的黑顺片、白附片、淡附片和炮附片，即是附子经过胆巴水浸制、煮、漂、蒸、晒等工艺加工炮制而成，然法定方法过程繁杂，可控性差，不同批次制附片中生物碱成分含量相差可高达10倍，有效成分流失严重，存在炮制过度之嫌[8-11]，且漂洗不彻底还可导致CaCl2，MgCl2等无机杂质的残留[12]。目前，已有文献报道了蒸制和烘制对附子6种酯型生物碱含量的影响[13]，本文进一步探讨附子直接蒸制或烘制方法的可行性，采用UPLC-MS/MS检测技术，研究13种主要生物碱成分的动态变化规律，以期为附子炮制提供简便可行的加工方法。
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1 材料
Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Agilent 6460型三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司)，Agilent Masshunter B.03.01 SP2工作站软件(美国Agilent公司)，KQ-100超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，TDL80-2B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，SYQ-DSX-280不锈钢压力蒸气灭菌器(上海申安医疗器械厂)，DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，AUW220D型1/10万天平(日本岛津公司)，Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)。
实验药材购于四川江油中坝附子科技发展有限公司，由四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定，为乌头A. carmichaelii Debx.子根的加工品。氢溴酸高乌甲素(lannaconitine，批号100289-200902)，苯甲酰次乌头原碱(benzoylhypaconine，批号111796-201002)，苯甲酰新乌头原碱(benzoylmeaconine，批号111795-200901)，苯甲酰乌头原碱(benzoylaconine，批号111794-200901)，乌头碱(aconitine，批号110720-200410)，新乌头碱(mesaconitine，批号110799-200505)，次乌头碱(hypaconitine，批号110798-201106)对照品购自中国食品药品检定研究院;去甲猪毛菜碱对照品(salsolinol，批号1-LJM-177-1)购自Toronto Research Chemicals Inc;乌头原碱(aconine，批号must-11051501)，宋果灵(songorine，批号must-12090504)，多根乌头碱(karacoline，批号must-13021802)，附子灵(fuziline，批号must-12090810)对照品购自成都曼思特生物科技有限公司;次乌头原碱(hypaconine)，新乌头原碱(mesaconine)对照品由本实验室从制川乌中分得，HPLC峰面积归一化法分析，纯度均≥98.0%;乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
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2 方法与结果
2.1 炮制加工方法与样品制备
湿热蒸制：取生附片6 kg，加适量水润透，分成6等份，置不锈钢压力蒸气灭菌器内，分别于120 ℃蒸10，20，40，60，90，120 min，晒干，即得蒸附片。
干热烘制：取生附片6 kg，分成6等份，置电热恒温鼓风干燥箱内，分别于150 ℃烘10，20，40，60，90，120 min，即得烘附片。
2.2 LC-MS/MS测定附子13种生物碱的含量
2.2.1 测定条件 液相条件：Agilent SB-C18色谱柱(2.1 mm×20 mm，1.8 μm);柱温35 ℃;流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，B相为2 mmol·L-1乙酸铵溶液+0.1%甲酸;流速0.4 mL·min-1;进样量1 μL。梯度洗脱：0～1.5 min，15%～20% A;1.5～5 min，20% ～70% A;5～5.1 min，70% ～100% A;5.1～8 min，100% A。, 百拇医药(杨昌林 黄志芳 张意涵 刘玉红 刘云华 陈燕 易进海)