不同品种不同生长期桑叶中生物碱类与黄酮类化学成分的积累动态分析评价(1)
[摘要] 对不同品种、不同生长期的11个品种88个桑叶样品中生物碱类、黄酮类资源性化学成分的积累动态进行分析评价，以期探讨桑叶的适宜采收期及桑叶的资源化利用途径。采用UPLC-TQ/MS联用技术对桑叶中的生物碱类、黄酮类成分进行分析评价。结果表明，不同品种、不同生长期桑叶中的生物碱类、黄酮类成分含量差异较大，随着物候期的顺延，生物碱类成分的含量呈总体下降趋势，10月份后大幅下降;黄酮类成分的含量变化较小，10月份之后亦呈下降趋势。广东桑中黄酮类成分远高于生物碱类成分，而鸡桑则相反;华桑和蒙桑中生物碱类成分在7-8月间迅速下降;白桑中的生物碱类、黄酮类成分含量均处于中等水平。综合分析，药用桑叶的适宜采收期在9月底10月初。研究结果为桑叶的合理采收及资源化利用提供了科学依据。
[关键词] 桑叶;生物碱类;黄酮类;积累动态
[收稿日期] 2014-06-22
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81373889)
, http://www.100md.com
[通信作者] 段金廒，Tel/Fax： (025) 85811116，E-mail： dja@ njutcm.edu.cn
桑叶为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶。初霜后采收，除去杂质，晒干。具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目之效。用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤眼花[1]。桑叶中含有生物碱类、黄酮类、甾醇类、多糖类等多种类型活性成分并具有降血糖、抗高血压、降血脂、抗动脉粥样硬化等多种药理作用[2-11]，因而近年来越来越多地受到国内外学者的关注。
传统入方桑叶有嫩桑叶和霜桑叶2种，如桑麻丸中使用嫩桑叶，代茶饮中使用霜桑叶(《医方简义》)。《新编中药志》中记载，桑叶霜降(10月下旬)后采收，嫩叶在夏季茂盛时采收。关于桑叶中效应成分的积累动态评价尚未见报道，本文采集7～12月共6批，每批11个品种88个桑叶样品，以探讨其生物碱类和黄酮类成分的变化规律，为桑叶的合理采收提供科学依据。
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1 材料
ACQUITY UPLC系统(包括四元溶剂系统，在线脱气机和自动进样器;Waters公司);Xevo TQ质谱系统(Waters公司);MassLynxTM质谱工作站(Waters公司);Sartorius BT125D型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);EPED超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司);KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);Anke GL-16GII型离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1-脱氧野尻霉素(DNJ)(1，T-021-120611)、荞麦碱(2，3-MSC-25-6)、紫云英苷(3，Z-020-120312)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷(4，111854-201202，下简称龙胆双糖苷)、异槲皮苷(5，Y-076-120325)、芦丁(6，10080-200707)均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用。
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样品分别于2012年7月1日，8月1日，9月1日，9月29日，11月1日和11月30日采自国家种质镇江桑树圃(江苏镇江)8年生冬伐桑树，所采叶位为第10～15叶位，样品采集后，立即于55 ℃烘干，真空包装，保存于-18 ℃冰箱中;样品信息由国家种质镇江桑树圃提供，见表1。
乙腈(色谱纯，Tedia)，无水乙醇(分析纯，南京化学试剂有限公司)，甲酸(色谱纯，Merck)，甲酸铵(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)，乙酸铵(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。实验用水均为超纯水，自制。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
2.1.1 用于生物碱类成分测定的供试品溶液制备 将干燥桑叶样品不开包装放置至室温，粉碎，过40目筛，取0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入超纯水25 mL，称重，静置30 min，超声(80 kHz，50 ℃)50 min，放冷，加超纯水补足减失质量，摇匀，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，即得。
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2.1.2 用于黄酮类成分测定的供试品溶液制备 取桑叶粉末0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，称重，静置30 min，超声(80 kHz，40 ℃)30 min，放冷，加70%乙醇补足减失质量，摇匀，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，即得。
2.2 对照品溶液的制备
2.2.1 生物碱对照品溶液的制备 取各对照品适量，精密称定，以10%甲醇溶解，配成DNJ、荞麦碱质量浓度分别为0.145 ，0.120 g·L-1的生物碱混合对照品溶液。
2.2.2 黄酮对照品溶液的制备 取各对照品适量，精密称定，以70%乙醇溶解，配成紫云英苷(3)、龙胆双糖苷(4)、异槲皮苷(5)、芦丁(6)的质量浓度分别为0.321， 0.208 ， 0.343 ， 0.262 g·L-1的黄酮混合对照品溶液。
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2.3 色谱条件
2.3.1 用于生物碱类成分测定的色谱条件 采用Waters Acquity UPLC BEH Amide (2.1 mm×100 mm， 1.7 μm)色谱柱，流动相A为含5 mmol·L-1甲酸铵、5 mmol·L-1乙酸铵和0.2%甲酸水溶液，B为含1 mmol·L-1甲酸铵、1 mmol·L-1乙酸铵和0.2%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱(0～3 min，10% A;3～9 min，10%～18% A;9～15 min，18%～20% A，15～16 min，20%～46% A，16～18 min，46% A)。流速0.4 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量1 μL。, http://www.100md.com(张丽丽 白永亮 宿树兰 欧阳臻 刘利 郭盛 钱大玮 段金廒)
[关键词] 桑叶;生物碱类;黄酮类;积累动态
[收稿日期] 2014-06-22
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81373889)
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[通信作者] 段金廒，Tel/Fax： (025) 85811116，E-mail： dja@ njutcm.edu.cn
桑叶为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶。初霜后采收，除去杂质，晒干。具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目之效。用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤眼花[1]。桑叶中含有生物碱类、黄酮类、甾醇类、多糖类等多种类型活性成分并具有降血糖、抗高血压、降血脂、抗动脉粥样硬化等多种药理作用[2-11]，因而近年来越来越多地受到国内外学者的关注。
传统入方桑叶有嫩桑叶和霜桑叶2种，如桑麻丸中使用嫩桑叶，代茶饮中使用霜桑叶(《医方简义》)。《新编中药志》中记载，桑叶霜降(10月下旬)后采收，嫩叶在夏季茂盛时采收。关于桑叶中效应成分的积累动态评价尚未见报道，本文采集7～12月共6批，每批11个品种88个桑叶样品，以探讨其生物碱类和黄酮类成分的变化规律，为桑叶的合理采收提供科学依据。
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1 材料
ACQUITY UPLC系统(包括四元溶剂系统，在线脱气机和自动进样器;Waters公司);Xevo TQ质谱系统(Waters公司);MassLynxTM质谱工作站(Waters公司);Sartorius BT125D型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);EPED超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司);KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);Anke GL-16GII型离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1-脱氧野尻霉素(DNJ)(1，T-021-120611)、荞麦碱(2，3-MSC-25-6)、紫云英苷(3，Z-020-120312)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷(4，111854-201202，下简称龙胆双糖苷)、异槲皮苷(5，Y-076-120325)、芦丁(6，10080-200707)均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用。
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样品分别于2012年7月1日，8月1日，9月1日，9月29日，11月1日和11月30日采自国家种质镇江桑树圃(江苏镇江)8年生冬伐桑树，所采叶位为第10～15叶位，样品采集后，立即于55 ℃烘干，真空包装，保存于-18 ℃冰箱中;样品信息由国家种质镇江桑树圃提供，见表1。
乙腈(色谱纯，Tedia)，无水乙醇(分析纯，南京化学试剂有限公司)，甲酸(色谱纯，Merck)，甲酸铵(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)，乙酸铵(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。实验用水均为超纯水，自制。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
2.1.1 用于生物碱类成分测定的供试品溶液制备 将干燥桑叶样品不开包装放置至室温，粉碎，过40目筛，取0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入超纯水25 mL，称重，静置30 min，超声(80 kHz，50 ℃)50 min，放冷，加超纯水补足减失质量，摇匀，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，即得。
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2.1.2 用于黄酮类成分测定的供试品溶液制备 取桑叶粉末0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，称重，静置30 min，超声(80 kHz，40 ℃)30 min，放冷，加70%乙醇补足减失质量，摇匀，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，即得。
2.2 对照品溶液的制备
2.2.1 生物碱对照品溶液的制备 取各对照品适量，精密称定，以10%甲醇溶解，配成DNJ、荞麦碱质量浓度分别为0.145 ，0.120 g·L-1的生物碱混合对照品溶液。
2.2.2 黄酮对照品溶液的制备 取各对照品适量，精密称定，以70%乙醇溶解，配成紫云英苷(3)、龙胆双糖苷(4)、异槲皮苷(5)、芦丁(6)的质量浓度分别为0.321， 0.208 ， 0.343 ， 0.262 g·L-1的黄酮混合对照品溶液。
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2.3 色谱条件
2.3.1 用于生物碱类成分测定的色谱条件 采用Waters Acquity UPLC BEH Amide (2.1 mm×100 mm， 1.7 μm)色谱柱，流动相A为含5 mmol·L-1甲酸铵、5 mmol·L-1乙酸铵和0.2%甲酸水溶液，B为含1 mmol·L-1甲酸铵、1 mmol·L-1乙酸铵和0.2%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱(0～3 min，10% A;3～9 min，10%～18% A;9～15 min，18%～20% A，15～16 min，20%～46% A，16～18 min，46% A)。流速0.4 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量1 μL。, http://www.100md.com(张丽丽 白永亮 宿树兰 欧阳臻 刘利 郭盛 钱大玮 段金廒)