黄连解毒汤乙酸乙酯提取物抑制白念珠菌菌丝的形成(1)
[摘要] 目的：探讨黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu decoction，EAHD)对白念珠菌菌丝形成的影响。方法：以0，78，312，1 250 mg·L-1EAHD干预白念珠菌6 h，采用倒置显微镜、荧光显微镜及扫描电镜分别观察白念珠菌菌丝形态;固体培养基上观测菌落形态;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测白念珠菌菌丝形成相关基因HWP1，ALS3，UME6，SUN41，CSH1，CaPDE2的表达量。结果：312，1 250 mg·L-1EAHD可显著抑制白念珠菌菌丝的形成及菌落的形态;qRT-PCR检测显示1 250 mg·L-1EAHD使HWP1，ALS3，UME6，CSH1表达分别下调4.13，3.64，2.46，2.75倍，SUN41表达上调7.26倍，CaPDE2表达无变化。结论：EAHD可能通过抑制HWP1，ALS3，UME6，CSH1等相关基因的表达来抑制白念珠菌菌丝的形成。
, 百拇医药
[关键词] 黄连解毒汤乙酸乙酯提取物;白念珠菌;菌丝
[收稿日期] 2014-04-02
[基金项目] 安徽省自然科学基金项目(1408085MH165);安徽中医药大学校级科研项目(2014zr026)
[通信作者] 汪长中，教授，主要从事抗真菌研究，E-mail：ahwcz63@sina.com
[作者简介] 汪天明，讲师，主要从事抗真菌研究，E-mail：wtm1818@163.com
白念珠菌为双相性真菌，以酵母和菌丝或假菌丝相存在。菌丝是由芽管延伸形成的无缢缩的多细胞形态，菌丝相细胞更易于附着及侵入宿主细胞和逃避机体免疫系统攻击，因此白念珠菌的致病性从细胞结构来讲主要由菌丝相造成。同时，菌丝也是白念珠菌生物膜的重要组分，生物膜的形成首先从酵母细胞黏附至底物上开始，继而微菌落形成、菌丝发育、成熟等，最后菌体将自身分泌的大量基质连同密集交织的菌丝及酵母相细胞共同构成三维的生物膜[1]，此时，对常规抗真菌药如氟康唑等的敏感性大大下降。因此，从天然产物中发掘抗真菌药物已成为抗真菌药物研发的一个重要渠道。黄连解毒汤出自《肘后备急方》，方名始见于《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成，为清热解毒的代表方。具有清热、泻火、解毒之功效，主治一切实热火毒、三焦热盛之证[2]。本实验组前期研究发现黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu decoction，EAHD)对白念珠菌黏附具有一定的抑制效应，本实验拟进一步探讨EAHD对菌丝形成的影响，旨在为中药治疗由白念珠菌引起的复发性、难治性真菌感染提供重要的实验依据。
, 百拇医药
1 材料
1.1 菌株 白念珠菌(Candida albicans)SC5314由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。
1.2 药物 黄连解毒汤所用药物黄连、黄芩、黄柏、栀子，购于安徽中医药大学第一附属医院中药房，并经鉴定。使用80%甲醇70 ℃回流2 h后过滤，收集滤渣，共重复回流3次后，滤液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液65 ℃旋转蒸发至结晶干燥，得到黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(EAHD);阳性对照药氟康唑(fluconazole，FLZ)标准品(中国食品药品检定研究院)。
1.3 试剂 pH 7.4磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solutions，PBS)，无水乙醇(上海苏懿化学试剂有限公司)，溶壁酶(Sigma公司)，Fluorescein diacetate (FDA)(Sigma公司)，25%戊二醛(国药集团化学试剂有限公司)，Total RNA提取试剂、PCR反应试剂(日本ToyoBo公司)，引物(上海生工生物工程有限公司)。
, http://www.100md.com
1.4 培养基 制备RPMI 1640液体培养基，用1 mol·L-1NaOH溶液调整该液体培养基在25 ℃的pH为(7.0±0.1)，滤过除菌，4 ℃保存备用。沙氏培养基(青岛高科技海博生物技术有限公司)，YPD沙氏培养基(北京陆桥技术责任有限公司)。
1.5 仪器 聚苯乙烯96孔微量培养板，24孔微量培养板(美国Corning公司)，培养皿，DPH-9162型电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，血细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司)，CKX41-32型倒置显微镜(日本Olympus公司)，DMI60000B倒置荧光显微镜(德国徕卡)，Sirion200扫描电镜(FEI)，AB SpectraMax M2e多功能酶标仪[美谷分子仪器(上海)有限公司]，I7000荧光定量PCR仪(美国生物应用系统公司)。
2 方法
2.1 菌悬液配制[3] 从4 ℃保存的沙氏培养平板上挑取单菌落白念珠菌，接种至液体沙氏培养液，37 ℃，200 r·min-1过夜培养，离心收集菌体，血细胞计数板计数，RPMI 1640培养液稀释至2×106CFU·mL-1备用。
2.2 倒置显微镜观察菌体形态 取100 μL菌液与100 μL终浓度分别为0，78，312，1 250 mg·L-1EAHD及256 mg·L-1FLZ于96孔板中混合，37 ℃，200 r·min-1培养6 h后，倒置显微镜观察菌丝形态。, 百拇医药(汪天明 严园园 施高翔 夏丹 邵菁 汪长中)
, 百拇医药
[关键词] 黄连解毒汤乙酸乙酯提取物;白念珠菌;菌丝
[收稿日期] 2014-04-02
[基金项目] 安徽省自然科学基金项目(1408085MH165);安徽中医药大学校级科研项目(2014zr026)
[通信作者] 汪长中，教授，主要从事抗真菌研究，E-mail：ahwcz63@sina.com
[作者简介] 汪天明，讲师，主要从事抗真菌研究，E-mail：wtm1818@163.com
白念珠菌为双相性真菌，以酵母和菌丝或假菌丝相存在。菌丝是由芽管延伸形成的无缢缩的多细胞形态，菌丝相细胞更易于附着及侵入宿主细胞和逃避机体免疫系统攻击，因此白念珠菌的致病性从细胞结构来讲主要由菌丝相造成。同时，菌丝也是白念珠菌生物膜的重要组分，生物膜的形成首先从酵母细胞黏附至底物上开始，继而微菌落形成、菌丝发育、成熟等，最后菌体将自身分泌的大量基质连同密集交织的菌丝及酵母相细胞共同构成三维的生物膜[1]，此时，对常规抗真菌药如氟康唑等的敏感性大大下降。因此，从天然产物中发掘抗真菌药物已成为抗真菌药物研发的一个重要渠道。黄连解毒汤出自《肘后备急方》，方名始见于《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成，为清热解毒的代表方。具有清热、泻火、解毒之功效，主治一切实热火毒、三焦热盛之证[2]。本实验组前期研究发现黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu decoction，EAHD)对白念珠菌黏附具有一定的抑制效应，本实验拟进一步探讨EAHD对菌丝形成的影响，旨在为中药治疗由白念珠菌引起的复发性、难治性真菌感染提供重要的实验依据。
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1 材料
1.1 菌株 白念珠菌(Candida albicans)SC5314由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。
1.2 药物 黄连解毒汤所用药物黄连、黄芩、黄柏、栀子，购于安徽中医药大学第一附属医院中药房，并经鉴定。使用80%甲醇70 ℃回流2 h后过滤，收集滤渣，共重复回流3次后，滤液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液65 ℃旋转蒸发至结晶干燥，得到黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(EAHD);阳性对照药氟康唑(fluconazole，FLZ)标准品(中国食品药品检定研究院)。
1.3 试剂 pH 7.4磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solutions，PBS)，无水乙醇(上海苏懿化学试剂有限公司)，溶壁酶(Sigma公司)，Fluorescein diacetate (FDA)(Sigma公司)，25%戊二醛(国药集团化学试剂有限公司)，Total RNA提取试剂、PCR反应试剂(日本ToyoBo公司)，引物(上海生工生物工程有限公司)。
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1.4 培养基 制备RPMI 1640液体培养基，用1 mol·L-1NaOH溶液调整该液体培养基在25 ℃的pH为(7.0±0.1)，滤过除菌，4 ℃保存备用。沙氏培养基(青岛高科技海博生物技术有限公司)，YPD沙氏培养基(北京陆桥技术责任有限公司)。
1.5 仪器 聚苯乙烯96孔微量培养板，24孔微量培养板(美国Corning公司)，培养皿，DPH-9162型电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，血细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司)，CKX41-32型倒置显微镜(日本Olympus公司)，DMI60000B倒置荧光显微镜(德国徕卡)，Sirion200扫描电镜(FEI)，AB SpectraMax M2e多功能酶标仪[美谷分子仪器(上海)有限公司]，I7000荧光定量PCR仪(美国生物应用系统公司)。
2 方法
2.1 菌悬液配制[3] 从4 ℃保存的沙氏培养平板上挑取单菌落白念珠菌，接种至液体沙氏培养液，37 ℃，200 r·min-1过夜培养，离心收集菌体，血细胞计数板计数，RPMI 1640培养液稀释至2×106CFU·mL-1备用。
2.2 倒置显微镜观察菌体形态 取100 μL菌液与100 μL终浓度分别为0，78，312，1 250 mg·L-1EAHD及256 mg·L-1FLZ于96孔板中混合，37 ℃，200 r·min-1培养6 h后，倒置显微镜观察菌丝形态。, 百拇医药(汪天明 严园园 施高翔 夏丹 邵菁 汪长中)