丹红注射液对缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护机制(1)
[摘要] 为研究丹红注射液对缺氧损伤脑微血管内皮细胞(rBMECs)的保护机制。该实验采用原代培养乳鼠脑微血管内皮细胞并进行Ⅷ因子鉴定，建立缺氧4 h损伤模型的同时，丹红注射液(25，50，100 mL·L-1)作用于rBMECs，生化法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平，RT-PCR法检测细胞MMP-9，ICAM-1，P53 mRNA表达水平，透射电镜观察细胞超显微结构变化。结果表明缺氧使原代培养的rBMECs受到明显损伤，与模型组比较，丹红注射液(50，100 mL·L-1)可显著对抗缺氧造成的损伤，增强SOD活性，降低MDA水平，明显下调MMP-9，ICAM-1，P53 mRNA的表达，丹红注射液100 mL·L-1能够保护细胞正常的形态、显微结构、维持细胞间紧密连接，抑制缺氧诱导的细胞凋亡。从结果中可以得出丹红注射液对缺氧损伤rBMECs具有明显的保护作用，其机制与增强细胞抗氧化能力，抑制炎症反应及细胞凋亡有关。
[关键词] 丹红注射液;乳鼠脑微血管内皮细胞(rBMECs);缺氧;抗氧化;炎症;细胞凋亡
, 百拇医药
[收稿日期] 2014-03-31
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81173647，81373898，81274176，81473587);浙江省自然科学基金项目(LR12H27001)
[通信作者] 万海同，教授，E-mail：wanhaitong@zjtcm.net
[作者简介] 周鹏，E-mail：zz198966@163.com
丹红注射液是由丹参、红花中药组成的复方制剂，丹红相辅祛瘀生新，除邪而不伤正，共奏活血化瘀、通脉舒络之功，临床研究表明丹红注射液治疗瘀血闭阻所致的胸痹及中风获得肯定疗效[1]。近年来国内外对丹红注射液用于脑血管疾病的基础研究与临床报道较多，本方治疗缺血性脑血管疾病有良好前景[2]。血脑屏障(blood brain barrier)的破坏是缺血性脑血管疾病研究的重点，而脑微血管内皮细胞及其紧密连接是血脑屏障的主要结构基础，是研究脑血管疾病的最佳细胞模型[3]。本研究采用原代培养的乳鼠脑微血管内皮细胞，建立体外rBMECs缺氧损伤模型，用丹红注射液对细胞缺氧损伤模型进行干预，从细胞水平和分子水平研究丹红注射液对缺氧所致rBMECs损伤的保护作用并探讨其作用机制，为其临床应用提供科学依据。
, 百拇医药
1 材料
1.1 动物 SD大鼠，雌雄兼用，3～5日龄，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，许可证号SCXK(沪)2008-0016，上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1.2 药品与试剂 丹红注射液(菏泽步长制药有限公司，国药准字Z20026866，批号12091021);M199培养基、胎牛血清(Gibco公司);D-Hank′s液、Ⅱ型胶原酶、PBS液、FITC标记山羊抗兔IgG、碘化丙锭(PI)、Folin-酚试剂、兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体、胰蛋白酶(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所);High Pure RNA Isolation Kit，Transcrptor First Stand cDNA synthesis kit(Roche公司);All-in-OneTM Q-PCR Primer Array(GeneCopoeia公司);β-actin上游引物5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′;ICAM-1上游引物5′-TCTCATGCCCGTGAAATTATG-3′，下游引物5′-TTGATTCAAAGGAAAGGCTTCT-3′;MMP-9上游引物5′-ATCTGTATGGTCGTGG- CTCTAA-3′，下游引物5′-TGGCTTCCTCCGTGATTCG-3′;P53上游引物5′-CAGCTTTGAGGTTGGTGTTTGT-3′，下游引物5′-ATGCTCTTCTTTTTTGC- GGAAA-3′;其余试剂均为市售分析纯。
, 百拇医药
1.3 仪器 SW-CJ-2D净化工作台(苏州净化设备有限公司);3111型CO2培养箱(Thermo Scientific公司);DMI4000B荧光倒置显微镜(德国徕卡公司);LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京京立离心机有限公司);TU-1900双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);Thermo Scientific Varioskan Flash酶标仪;荧光定量PCR仪(BIO-RAD);JEM-1230型透射电镜(日本JEOL公司);eppendorf移液枪，自制缺氧罐。
2 方法
2.1 rBMECs的原代培养[4] 取8只3～5日龄SD乳鼠，脱颈椎处死，置于75%乙醇中浸泡3～5 min后，无菌条件下沿大鼠脑正中线剪开颅骨，剔除硬脑膜，取出大脑半球，去除小脑和脑干，用细解剖镊尽量去除软脑膜、大血管、白质组织。用D-Hank′s液漂洗3次后，将大脑皮质移入无菌的培养皿中，用虹膜剪将其剪碎至1 mm3(以上操作在冰袋上进行)。剪碎的灰质组织用含EDTA的0.25%胰蛋白酶37 ℃消化20 min，5 min摇晃1次，加入含有10%胎牛血清的M199培养液终止消化，吹打均匀，依次通过80目和200目不锈钢筛滤过，收集200目上的团块滤液，1 000 r·min-1离心10 min。将沉淀悬浮于0.1%Ⅱ型胶原酶溶液中，吹打均匀，37 ℃消化25 min，5 min摇晃1次，1 000 r·min-1离心10 min。将下层沉淀用M199培养基漂洗1次，再次离心，沉淀用M199完全培养基悬浮，接种到细胞培养瓶中，37 ℃，5%CO2培养箱内静置培养，常规4 d后首次换液，以后每2 d换液1次，约7～8 d细胞生长成致密单层后，用胰酶消化传代培养，以3～4代细胞用于实验。, 百拇医药(周鹏 何昱 杨洁红 张宇燕 周惠芬 赵涛 付巍 万海同)
[关键词] 丹红注射液;乳鼠脑微血管内皮细胞(rBMECs);缺氧;抗氧化;炎症;细胞凋亡
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[收稿日期] 2014-03-31
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81173647，81373898，81274176，81473587);浙江省自然科学基金项目(LR12H27001)
[通信作者] 万海同，教授，E-mail：wanhaitong@zjtcm.net
[作者简介] 周鹏，E-mail：zz198966@163.com
丹红注射液是由丹参、红花中药组成的复方制剂，丹红相辅祛瘀生新，除邪而不伤正，共奏活血化瘀、通脉舒络之功，临床研究表明丹红注射液治疗瘀血闭阻所致的胸痹及中风获得肯定疗效[1]。近年来国内外对丹红注射液用于脑血管疾病的基础研究与临床报道较多，本方治疗缺血性脑血管疾病有良好前景[2]。血脑屏障(blood brain barrier)的破坏是缺血性脑血管疾病研究的重点，而脑微血管内皮细胞及其紧密连接是血脑屏障的主要结构基础，是研究脑血管疾病的最佳细胞模型[3]。本研究采用原代培养的乳鼠脑微血管内皮细胞，建立体外rBMECs缺氧损伤模型，用丹红注射液对细胞缺氧损伤模型进行干预，从细胞水平和分子水平研究丹红注射液对缺氧所致rBMECs损伤的保护作用并探讨其作用机制，为其临床应用提供科学依据。
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1 材料
1.1 动物 SD大鼠，雌雄兼用，3～5日龄，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，许可证号SCXK(沪)2008-0016，上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1.2 药品与试剂 丹红注射液(菏泽步长制药有限公司，国药准字Z20026866，批号12091021);M199培养基、胎牛血清(Gibco公司);D-Hank′s液、Ⅱ型胶原酶、PBS液、FITC标记山羊抗兔IgG、碘化丙锭(PI)、Folin-酚试剂、兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体、胰蛋白酶(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所);High Pure RNA Isolation Kit，Transcrptor First Stand cDNA synthesis kit(Roche公司);All-in-OneTM Q-PCR Primer Array(GeneCopoeia公司);β-actin上游引物5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′;ICAM-1上游引物5′-TCTCATGCCCGTGAAATTATG-3′，下游引物5′-TTGATTCAAAGGAAAGGCTTCT-3′;MMP-9上游引物5′-ATCTGTATGGTCGTGG- CTCTAA-3′，下游引物5′-TGGCTTCCTCCGTGATTCG-3′;P53上游引物5′-CAGCTTTGAGGTTGGTGTTTGT-3′，下游引物5′-ATGCTCTTCTTTTTTGC- GGAAA-3′;其余试剂均为市售分析纯。
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1.3 仪器 SW-CJ-2D净化工作台(苏州净化设备有限公司);3111型CO2培养箱(Thermo Scientific公司);DMI4000B荧光倒置显微镜(德国徕卡公司);LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京京立离心机有限公司);TU-1900双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);Thermo Scientific Varioskan Flash酶标仪;荧光定量PCR仪(BIO-RAD);JEM-1230型透射电镜(日本JEOL公司);eppendorf移液枪，自制缺氧罐。
2 方法
2.1 rBMECs的原代培养[4] 取8只3～5日龄SD乳鼠，脱颈椎处死，置于75%乙醇中浸泡3～5 min后，无菌条件下沿大鼠脑正中线剪开颅骨，剔除硬脑膜，取出大脑半球，去除小脑和脑干，用细解剖镊尽量去除软脑膜、大血管、白质组织。用D-Hank′s液漂洗3次后，将大脑皮质移入无菌的培养皿中，用虹膜剪将其剪碎至1 mm3(以上操作在冰袋上进行)。剪碎的灰质组织用含EDTA的0.25%胰蛋白酶37 ℃消化20 min，5 min摇晃1次，加入含有10%胎牛血清的M199培养液终止消化，吹打均匀，依次通过80目和200目不锈钢筛滤过，收集200目上的团块滤液，1 000 r·min-1离心10 min。将沉淀悬浮于0.1%Ⅱ型胶原酶溶液中，吹打均匀，37 ℃消化25 min，5 min摇晃1次，1 000 r·min-1离心10 min。将下层沉淀用M199培养基漂洗1次，再次离心，沉淀用M199完全培养基悬浮，接种到细胞培养瓶中，37 ℃，5%CO2培养箱内静置培养，常规4 d后首次换液，以后每2 d换液1次，约7～8 d细胞生长成致密单层后，用胰酶消化传代培养，以3～4代细胞用于实验。, 百拇医药(周鹏 何昱 杨洁红 张宇燕 周惠芬 赵涛 付巍 万海同)