银杏叶提取物对泪腺腺样囊性癌 ACC—2细胞增殖及Survivin，TIP30基因表达的影响(1)
[摘要] 探讨银杏叶提取物(EGB)对泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞增殖、凋亡的影响，并从基因和蛋白水平上分析EGB对Survivin和TIP30基因表达的影响。不同浓度EGB处理体外培养的人泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞，应用MTT法检测细胞增殖;Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期;RT-PCR和Western blotting分析Survivin，TIP30基因和蛋白的表达。结果发现EGB对ACC-2细胞的体外增殖具有抑制作用，量效关系显著，与对照组比较有统计学差异(P<0.01)，半数抑制浓度(IC50)为88 mg·L-1。经流式细胞仪检测表明，EGB能使ACC-2细胞G0/G1期逐渐增加，G2/M期和S期逐渐减少，并且随着剂量的增加，ACC-2细胞凋亡率明显增加(P<0.05或P<0.01)。RT-PCR与Western杂交结果一致表明随着EGB浓度的升高，Survivin基因表达明显减少(P<0.01)，而TIP30基因表达则显著提高(P<0.01)。因此，EGB能有效抑制人泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞Survivin基因表达，并促进TIP30的表达，诱导ACC-2细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖。该研究为中药成分在肿瘤治疗中的应用提供了一定的理论和实验依据。
, 百拇医药
[关键词] 银杏叶提取物;ACC-2细胞;Survivin基因;TIP30基因
[收稿日期] 2014-06-20
[通信作者] 赵新霞，Tel：(0371)63388789，E-mail：zxxybfq@sohu.com
[作者简介] 牛坡，Tel：(0371)65580723，E-mail：nippi2001@tom.com
泪腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是泪腺恶性上皮性肿瘤中最为常见并且恶性程度最高的肿瘤，其发病率约占泪腺上皮性肿瘤的29%，仅次于多形性腺瘤，居于第2位[1]。其对常规放、化疗不敏感，以手术治疗为主，但由于该肿瘤生长具有较强的浸润性，好沿神经侵袭生长[2]，手术无法根除，术后复发率高且远期疗效较差，治疗比较棘手。因此，探求新的治疗方法已成为ACC研究的新方向。
, 百拇医药
银杏叶提取物(extract of Ginkgo biloba，EGB)对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，能诱导多种肿瘤细胞凋亡[3-4]，并能增强化疗药物的抑瘤作用，但其对ACC的抗肿瘤作用及其机制研究尚未见报道。Survivin是近年新发现的凋亡抑制因子，通过抑制Caspase级联反应下游的Caspase-3和Caspase-7活性，起到抑制细胞凋亡的作用，是目前肿瘤相关基因研究的热点问题之一[5-8]。TIP30是一种抑癌基因，可特异性作用于HIV-I长末端重复序列的蛋白，具有抑制细胞增殖，促进细胞凋亡及抑制细胞血管生成的作用。本研究通过观察EGB对泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞增殖、凋亡及Survivin，TIP30基因表达的影响，探讨EGB可能的抗肿瘤作用机制，为其进一步临床应用提供实验依据和理论基础。
1 材料
1.1 药物与试剂 银杏叶提取物(EGB761，商品名：金纳多)，德国威玛舒培博士药厂生产，批号1140808。RT-PCR试剂盒购自德国Qiagen公司;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司;Survivin抗体、TIP30抗体购自美国Santa Cruz公司;RPMI-1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司;MTT、二甲基亚砜、琼脂糖购自美国Amresco公司;Trizol总RNA抽提试剂购自Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶，Oligod，RNAsin购自美国Promage公司;引物由上海生工生物技术有限公司合成。
, 百拇医药
1.2 细胞株 人泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞购于中国科学院上海生命科学研究院。用含10%胎牛血清、2%的谷氨酰胺的RPMI-1640培养液，在37 ℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养。
1.3 仪器 CO2培养箱(MCO175，SANYO);倒置显微镜(IX-70，Olympus);水平流超净工作台(ZHJH-2112);流式细胞仪(FACS Calibur， Becton Dickinson);PCR扩增仪(Roche);ELX800型酶标仪。
2 方法
2.1 MTT法测定细胞增殖 取对数生长期的ACC-2细胞制成2×107个/mL细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 μL，培养24 h。然后加入EGB，使其终浓度分别为0，10，20，40，80，160 mg·L-1，同时设对照孔和调零孔，每组6个复孔。继续培养48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，再培养4 h后吸去全部上清液，然后每孔加入200 μL二甲基亚砜，振荡摇匀终止反应，使用酶标仪在490 nm处测吸光度(A)，计算肿瘤细胞增殖抑制率。
抑制率=(A对照组-A对物组)/ A对照组×100%, 百拇医药(牛坡 赵新霞 燕飞 周雍明 简鹏)
, 百拇医药
[关键词] 银杏叶提取物;ACC-2细胞;Survivin基因;TIP30基因
[收稿日期] 2014-06-20
[通信作者] 赵新霞，Tel：(0371)63388789，E-mail：zxxybfq@sohu.com
[作者简介] 牛坡，Tel：(0371)65580723，E-mail：nippi2001@tom.com
泪腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是泪腺恶性上皮性肿瘤中最为常见并且恶性程度最高的肿瘤，其发病率约占泪腺上皮性肿瘤的29%，仅次于多形性腺瘤，居于第2位[1]。其对常规放、化疗不敏感，以手术治疗为主，但由于该肿瘤生长具有较强的浸润性，好沿神经侵袭生长[2]，手术无法根除，术后复发率高且远期疗效较差，治疗比较棘手。因此，探求新的治疗方法已成为ACC研究的新方向。
, 百拇医药
银杏叶提取物(extract of Ginkgo biloba，EGB)对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，能诱导多种肿瘤细胞凋亡[3-4]，并能增强化疗药物的抑瘤作用，但其对ACC的抗肿瘤作用及其机制研究尚未见报道。Survivin是近年新发现的凋亡抑制因子，通过抑制Caspase级联反应下游的Caspase-3和Caspase-7活性，起到抑制细胞凋亡的作用，是目前肿瘤相关基因研究的热点问题之一[5-8]。TIP30是一种抑癌基因，可特异性作用于HIV-I长末端重复序列的蛋白，具有抑制细胞增殖，促进细胞凋亡及抑制细胞血管生成的作用。本研究通过观察EGB对泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞增殖、凋亡及Survivin，TIP30基因表达的影响，探讨EGB可能的抗肿瘤作用机制，为其进一步临床应用提供实验依据和理论基础。
1 材料
1.1 药物与试剂 银杏叶提取物(EGB761，商品名：金纳多)，德国威玛舒培博士药厂生产，批号1140808。RT-PCR试剂盒购自德国Qiagen公司;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司;Survivin抗体、TIP30抗体购自美国Santa Cruz公司;RPMI-1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司;MTT、二甲基亚砜、琼脂糖购自美国Amresco公司;Trizol总RNA抽提试剂购自Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶，Oligod，RNAsin购自美国Promage公司;引物由上海生工生物技术有限公司合成。
, 百拇医药
1.2 细胞株 人泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞购于中国科学院上海生命科学研究院。用含10%胎牛血清、2%的谷氨酰胺的RPMI-1640培养液，在37 ℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养。
1.3 仪器 CO2培养箱(MCO175，SANYO);倒置显微镜(IX-70，Olympus);水平流超净工作台(ZHJH-2112);流式细胞仪(FACS Calibur， Becton Dickinson);PCR扩增仪(Roche);ELX800型酶标仪。
2 方法
2.1 MTT法测定细胞增殖 取对数生长期的ACC-2细胞制成2×107个/mL细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 μL，培养24 h。然后加入EGB，使其终浓度分别为0，10，20，40，80，160 mg·L-1，同时设对照孔和调零孔，每组6个复孔。继续培养48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，再培养4 h后吸去全部上清液，然后每孔加入200 μL二甲基亚砜，振荡摇匀终止反应，使用酶标仪在490 nm处测吸光度(A)，计算肿瘤细胞增殖抑制率。
抑制率=(A对照组-A对物组)/ A对照组×100%, 百拇医药(牛坡 赵新霞 燕飞 周雍明 简鹏)