罗汉果实时荧光定量PCR内参基因的选择(1)
[摘要]罗汉果为药食两用的传统中药，研究从罗汉果转录组中选取了Actin，18SrRNA，ubiquilin，ef1-α，ef1-β，Tubulin作为候选基因，通过实时荧光定量PCR，利用geNorm，NormFinder，BestKeeper，Delta CT，RefFinder软件和方法对6个候选参考基因在不同罗汉果样品中的表达稳定性进行分析，首次筛选出了不同时期的有籽和无籽罗汉果果实中较理想的内参基因，结果发现18SrRNA在所有罗汉果样品中表达最稳定，是样品基因分析适合的内参基因，对采用qRT-PCR方法分析罗汉果基因表达中内参基因的选择具有指导作用，也为罗汉果生物合成途径基因及其他不同条件下基因差异表达研究提供参考，确保罗汉果基因表达分析结果的可靠性。
[关键词]罗汉果;内参基因;实时定量PCR
Selection of reference genes of Siraitia grosvenorii by real-time PCR
, 百拇医药
TU Dong-ping1， MO Chang-ming2， MA Xiao-jun1*， ZHAO Huan1， TANG Qi3， HUANG Jie4， PAN Li-mei2，WEI Rong-chang2
(1.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union
Medical College， Beijing 100193， China; 2.Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China;
, 百拇医药 3.Horticulture & Landscape College， Hunan Agriculture University， Changsha 410128， China;
4.Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China)
[Abstract]Siraitia grosvenorii is a traditional Chinese medicine also as edible food. This study selected six candidate reference genes by real-time quantitative PCR， the expression stability of the candidate reference genes in the different samples was analyzed by using the software and methods of geNorm， NormFinder， BestKeeper， Delta CT method and RefFinder， reference genes for S. grosvenorii were selected for the first time. The results showed that 18SrRNA expressed most stable in all samples， was the best reference gene in the genetic analysis. The study has a guiding role for the analysis of gene expression using qRT-PCR methods， providing a suitable reference genes to ensure the results in the study on differential expressed gene in synthesis and biological pathways， also other genes of S. grosvenorii.
, 百拇医药
[Key words]Siraitia grosvenorii; reference gene; real-time quantitative PCR
doi：10.4268/cjcmm20150208
实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是基因分析的重要工具。但在数据处理过程中，结果往往会受到不同变量的影响，因此，选用稳定表达的基因作为内参基因对准确分析实验结果非常关键。理想的内参基因应在所有组织和细胞类型中均能表达，且不受任何因素的影响。然而，任何内参基因的恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素下有范围的恒定，并非绝对的稳定表达[1-2]。候选基因在不同组织和不同时期的表达丰度有一定的变化，可能与它们所处的细胞类型和状态有关[3]。
罗汉果Siraitia grosvenorii是重要的传统中药。其味甘、性凉，具有清热解毒、止咳祛痰、凉血舒胃、清肺润肠等作用[4]，是中国特有药用植物。罗汉果除用作饮片外，仅以罗汉果冠名的中成药就有几十种，被卫生部、国家中医药管理局列入药食同源中药名录。其有效成分罗汉果甜苷V为四环三萜类，是蔗糖甜度的400倍，具有治疗功能，但由于其含量少且人工合成成本高，近年来，本课题组致力于该化合物生物合成的分子调控。如韦荣昌等[5]使用18S核糖体RNA(18SrRNA)作为内参基因，分析罗汉果中脱氢抗坏血酸还原酶 (DHAR) 基因的表达情况，发现与无籽罗汉果的败育有关。赵欢[6]使用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因为qRT-PCR的内参基因，分析葫芦二烯醇合酶(CS)基因在不同时期罗汉果样品中的表达量，但未见罗汉果内参基因的筛选的报道。本研究选取罗汉果的肌动蛋白基因Actin，18SrRNA，泛素酶基因ubiquilin，真核延伸因子ef1-α，ef1-β及微管蛋白基因Tubulin作为候选参考基因，设计特异性引物，使用26种不同的样品进行定量PCR检测，并用RefFinder网页进行geNorm，Bestkeeper，NormFinder及ΔCt分析基因表达的稳定性，为罗汉果生物合成关键基因、种子败育基因、单性结实相关基因、诱导基因及其他基因差异表达研究提供适合的内参基因，确保罗汉果基因表达分析结果的可靠性。, http://www.100md.com(涂冬萍 莫长明 马小军 赵欢 唐其 黄杰 潘丽梅 韦荣昌)
[关键词]罗汉果;内参基因;实时定量PCR
Selection of reference genes of Siraitia grosvenorii by real-time PCR
, 百拇医药
TU Dong-ping1， MO Chang-ming2， MA Xiao-jun1*， ZHAO Huan1， TANG Qi3， HUANG Jie4， PAN Li-mei2，WEI Rong-chang2
(1.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union
Medical College， Beijing 100193， China; 2.Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China;
, 百拇医药 3.Horticulture & Landscape College， Hunan Agriculture University， Changsha 410128， China;
4.Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China)
[Abstract]Siraitia grosvenorii is a traditional Chinese medicine also as edible food. This study selected six candidate reference genes by real-time quantitative PCR， the expression stability of the candidate reference genes in the different samples was analyzed by using the software and methods of geNorm， NormFinder， BestKeeper， Delta CT method and RefFinder， reference genes for S. grosvenorii were selected for the first time. The results showed that 18SrRNA expressed most stable in all samples， was the best reference gene in the genetic analysis. The study has a guiding role for the analysis of gene expression using qRT-PCR methods， providing a suitable reference genes to ensure the results in the study on differential expressed gene in synthesis and biological pathways， also other genes of S. grosvenorii.
, 百拇医药
[Key words]Siraitia grosvenorii; reference gene; real-time quantitative PCR
doi：10.4268/cjcmm20150208
实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是基因分析的重要工具。但在数据处理过程中，结果往往会受到不同变量的影响，因此，选用稳定表达的基因作为内参基因对准确分析实验结果非常关键。理想的内参基因应在所有组织和细胞类型中均能表达，且不受任何因素的影响。然而，任何内参基因的恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素下有范围的恒定，并非绝对的稳定表达[1-2]。候选基因在不同组织和不同时期的表达丰度有一定的变化，可能与它们所处的细胞类型和状态有关[3]。
罗汉果Siraitia grosvenorii是重要的传统中药。其味甘、性凉，具有清热解毒、止咳祛痰、凉血舒胃、清肺润肠等作用[4]，是中国特有药用植物。罗汉果除用作饮片外，仅以罗汉果冠名的中成药就有几十种，被卫生部、国家中医药管理局列入药食同源中药名录。其有效成分罗汉果甜苷V为四环三萜类，是蔗糖甜度的400倍，具有治疗功能，但由于其含量少且人工合成成本高，近年来，本课题组致力于该化合物生物合成的分子调控。如韦荣昌等[5]使用18S核糖体RNA(18SrRNA)作为内参基因，分析罗汉果中脱氢抗坏血酸还原酶 (DHAR) 基因的表达情况，发现与无籽罗汉果的败育有关。赵欢[6]使用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因为qRT-PCR的内参基因，分析葫芦二烯醇合酶(CS)基因在不同时期罗汉果样品中的表达量，但未见罗汉果内参基因的筛选的报道。本研究选取罗汉果的肌动蛋白基因Actin，18SrRNA，泛素酶基因ubiquilin，真核延伸因子ef1-α，ef1-β及微管蛋白基因Tubulin作为候选参考基因，设计特异性引物，使用26种不同的样品进行定量PCR检测，并用RefFinder网页进行geNorm，Bestkeeper，NormFinder及ΔCt分析基因表达的稳定性，为罗汉果生物合成关键基因、种子败育基因、单性结实相关基因、诱导基因及其他基因差异表达研究提供适合的内参基因，确保罗汉果基因表达分析结果的可靠性。, http://www.100md.com(涂冬萍 莫长明 马小军 赵欢 唐其 黄杰 潘丽梅 韦荣昌)