羌活不同地理种群ITS序列变异及系统发生分析(2)

http://www.100md.com 2015年10月1日 中国中药杂志2015年第19期

     2方法

    2.1基因组DNA的提取与检测依据改良的CTAB法从硅胶干燥的叶片中提取总DNA。通过测定紫外吸光度来确定DNA浓度和纯度。利用08%琼脂糖凝胶电泳检查DNA完整性。

    2.2PCR扩增与DNA测序采用真核生物rDNAITS 序列扩增引物ITS Primer A：5′CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA3′和ITS Primer B：5′TTCCCTGTTCACTCGCCGTTAC T3′，对羌活和宽叶羌活rDNA ITS序列进行PCR 扩增。反应体系为25 μL，内含25 mmol·L-1 MgCl2 2 μL，25 mmol·L-1 dNTPs 2 μL，10 μmol·L-1引物各06 μL，25 ng 模板，10×buffer 25 μL，1 U Taq DNA 聚合酶(TaKaRa)。使用Eppendorf Mastercycler Gradient PCR仪进行扩增反应， 扩增条件为95 ℃预变性3 min；35个循环：95 ℃变性05 min，51 ℃退火05 min ......