雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析(2)
2.4TwMCT基因的表达分析选取生长状况良好且一致的雷公藤悬浮细胞作为实验材料，在继代培养第10天，使用50μmol·L-1茉莉酸甲酯诱导悬浮细胞，溶剂DMSO处理的悬浮细胞作为对照，在处理后0，1，4，12，24，48，72h分别取样，用吸水纸吸干，液氮速冻后-80℃保存。每个时间点平行处理3个样品。每个样品的RNA提取，精制参考前述方法进行。以总RNA为模板，参照天根QuantcDNA第一链合成试剂盒说明书，进行反转录，合成cDNA，所得cDNA用于实时荧光定量扩增(RT-qPCR)。依据克隆得到的TwMCT全长序列设计引物，管家基因actin作为内参使用(表1)。为了检测目的基因引物和内参基因引物质量，以0hcDNA为模板，actin引物和RT-MCT引物分别进行普通PCR，电泳检测条带。以cDNA为模板，检测合格的actin和RT-MCT引物，在ABI7500RT-PCR仪上进行RT-qPCR分析。反应体系：10μL2×qPCRMasterMix，0.4μL50×ROXreferenceDyelow ......
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