菟丝子、莱菔子与其易混淆品的快速PCR法鉴别研究(2)

http://www.100md.com 2016年1月15日 《中国中药杂志》2016年第2期

     1.7 条件优化

    分别利用菟丝子和莱菔子特异性鉴别引物对TSZ-F1/R1，LFZ-F1/R1进行PCR反应，并考察：①退火温度(62，64，66，68，70℃)；⑦PCR循环数(26，28，30)；③变性温度(88，90，92，94℃)；④变性和退火时间(5，10，15，20，30s)；⑤不同引物浓度(2.5，5，10pmol·L^-1)；⑥不同PCR仪(GeneAmp9700型PCR扩增仪、Verit96孔梯度PCR扩增仪、TC-512梯度PCR仪)对PCR反应稳定性的影响。

    1.8 PCR产物检测

    在PCR扩增产物中加入1μL100×SYBRGreen Ⅰ于365 nm紫外波长下检测荧光，出现绿色荧光则表明存在阳性扩增产物。

    2 结果分析

    2.1 鉴别引物设计及验证

    选择通用引物ITS对菟丝子、莱菔子与其易混淆品样品进行PCR扩增，扩增结果见图1。然后通过Clustal W软件进行序列比对，根据其变异区设计

    2 对特异性鉴别引物。

    利用位点特异性PER方法对特异性鉴别引物进行验证，结果发现通过利用菟丝子位点特异PCR引物对以上样品进行扩增，菟丝子可以扩增出1条带，而其易混淆品则扩增不出条带；而使用莱菔子位点特异PCR引物，莱菔子可以扩增出1条带 ......