丹酚酸B大鼠在体鼻循环吸收研究(1)
[摘要]该实验研究了丹酚酸B在大鼠的鼻腔吸收特性，建立了HPLC测定灌流液中丹酚酸B的方法，考察了丹酚酸B的不同pH缓冲液对鼻腔的刺激性以及在鼻灌流液中的稳定性，并系统研究了丹酚酸B在体鼻黏膜吸收特性。采用改良的大鼠在体鼻循环模型，通过测定鼻灌流液中总蛋白和乳酸脱氢酶(LDH)的释放量，定量评价pH4.0，5.0，6.0丹酚酸B磷酸缓冲液对大鼠鼻黏膜的刺激性及其在鼻灌流液中的稳定性，比较低、中、高质量浓度(200，400，800mg·L-1)的pH5.0丹酚酸B缓冲液中丹酚酸B大鼠鼻腔吸收特性。结果表明，鼻腔刺激性：pH4.0>pH5.0>pH6.0，pH6.0丹酚酸B缓冲液24h内变化的RSD为3.1%，稳定性差。优选刺激性小，稳定性好的pH5.0丹酚酸B缓冲液，其大鼠鼻灌流试验显示，丹酚酸B的鼻腔吸收符合一级吸收模型，为被动扩散。pH5.0的丹酚酸B缓冲液对鼻腔刺激性小，稳定性良好，在大鼠鼻灌流试验中吸收良好，对丹酚酸B鼻用制剂的开发有一定的意义。
[关键词]丹酚酸B；pH；刺激性；稳定性；大鼠鼻腔吸收
丹酚酸B(salvianolic acid B，SalB)，又称丹参酚酸B、丹参酸B、丹酚酸乙，是传统活血化瘀中药丹参的水溶性物质中活性最强的酚酸类化合物。丹酚酸B为3分子丹参素与1分子咖啡酸缩合而成，含量丰富，占丹参干重的2%～8%，约占总酚酸质量的60%。研究表明丹酚酸B有明确的抗脑缺血损伤作用，其作用与抗氧化、清除自由基、神经保护及血脑屏障保护等密切相关。药物经鼻腔给药，由鼻黏膜直接吸收入血，起效迅速，避免血脑屏障阻碍，具有显著的脑靶向性，对于脑中风患者鼻腔给药途径更具优势。因此为了开发丹酚酸B鼻腔给药制剂，本实验采用改良的大鼠在体鼻灌流模型考察丹酚酸B鼻腔吸收情况。
1 材料
Sartorius BT 125D电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；Techcomp CT15RT高速离心机(上海天美科学仪器厂)；DB-300电子蠕动泵(上海之信仪器有限公司)；FE20实验室oH计(上海梅特勒—托利多仪器有限公司)；LC-20A岛津高效液相色谱仪(四元泵，紫外检测器)。
丹酚酸B对照品(中国食品药品检定研究院，批号11562-201313，以97.0%计)；丹酚酸B提取物(上海源叶生物科技有限公司，批号115939-25-8，以95.0%计)；非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)；乳酸脱氢酶LDH活力定量测定试剂盒(普利莱基因技术有限公司)；磷酸二氢钠(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团)；其他试剂均为分析纯。
SD大鼠，雄性，体重(250±20)g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2012-0001。
2 方法与结果
2.1 丹酚酸B含量测定
2.1.1 色谱条件DiamonsilTM钻石C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相甲醇-乙腈-甲酸-水(30：7：1：62)，检测波长286nm，流速1.0mL·min-1，进样量10μL，柱温30℃，丹酚酸B出峰时间14.20min，该条件下，系统适应性良好，见图1。
2.1.2 线性关系考察 精密称取丹酚酸B对照品20.60mg，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并配制成对照品储备液。精密量取一定量的对照品储备液，用甲醇分别稀释为49.96，199.82，399.64，799.28，1498.65mg·L-1对照品溶液。在选定的色谱条件下，测定丹酚酸B的峰面积，以峰面积(4)对质量浓度(C)进行回归，标准曲线方程为A：13251C+15375，r=0.9995，丹酚酸B在49.96～1498.65mg·L-1与峰面积线性关系良好。
2.1.3 精密度考察 精密吸取同一对照品溶液，重复进样6次，峰面积的RSD为0.076%，表明仪器的精密度良好。
2.1.4 稳定性考察 以空白鼻灌流液分别配制低、中、高质量浓度(200，400，800mg·L-1)的丹酚酸B溶液，在4℃下放置不同时间(0，3，6，12，24h)后，15000r·min-1离心15min，吸取上清液进样，测定丹酚酸B的峰面积，其24h内RSD为1.0%，0.71%，0.72%，表明鼻灌流液中丹酚酸B在4℃下24h内稳定。
2.1.5 回收率考察 精密称取丹酚酸B对照品，以空白鼻灌流液分别配制低、中、高质量浓度的丹酚酸B溶液，15000r·min-1离心15min，吸取上清液进样测定，计算测得含量，与理论值进行比较计算回收率，结果显示回收率在95.0%～105%，说明该方法准确，结果见表1。
2.2 大鼠鼻腔循环灌流试验
2.2.1 动物模型的准备 体重(250±20)g，SD雄性大鼠，饲养1～3d，待其充分适应环境后，正常饮水，禁食12h。大鼠腹腔注射20%乌拉坦(1.0g·kg-1)麻醉，仰卧固定于鼠板上，于颈部切口暴露气管和食管。取聚乙烯管2支，一支插入气管，另一支的一端插入食管，直至鼻腔底部。用胶黏剂将鼻腔与口腔的鼻腭通道封闭，以防药液流入口腔，管子的另一端与蠕动泵硅胶管相接后，硅胶管另一端插入药液底部，启动蠕动泵使药液循环。
2.2.2 鼻腔灌流循环试验 循环液体积流量设为2.5mL·min-1。首先以生理盐水10mL循环10min，测定循环前后的生理盐水体积，若体积变化小于0.1mL则整个环路密封性良好，无漏液情况。排尽生理盐水后，取5mL药液置5mL量筒中，37℃水浴恒温，将蠕动泵进液管插入量筒底部，启动蠕动泵，待大鼠鼻中药液滴出时开始计时，设为0时，于0，10，20，30，45，60，90，120min读取量筒中剩余药液体积V后取样0.25mL，补加循环药液0.25mL，样品15000r·min-1高速离心15min，吸取上清液0.15mL，以HPLC进行测定各时间剩余药物浓度Cn。其中循环死体积为VD：=(5-V0)。剩余药量Qn采用体积校正法来计算。 (杜秋 杜守颖 李鹏跃 陆洋 白洁 滕会会 王振 张晴)
[关键词]丹酚酸B；pH；刺激性；稳定性；大鼠鼻腔吸收
丹酚酸B(salvianolic acid B，SalB)，又称丹参酚酸B、丹参酸B、丹酚酸乙，是传统活血化瘀中药丹参的水溶性物质中活性最强的酚酸类化合物。丹酚酸B为3分子丹参素与1分子咖啡酸缩合而成，含量丰富，占丹参干重的2%～8%，约占总酚酸质量的60%。研究表明丹酚酸B有明确的抗脑缺血损伤作用，其作用与抗氧化、清除自由基、神经保护及血脑屏障保护等密切相关。药物经鼻腔给药，由鼻黏膜直接吸收入血，起效迅速，避免血脑屏障阻碍，具有显著的脑靶向性，对于脑中风患者鼻腔给药途径更具优势。因此为了开发丹酚酸B鼻腔给药制剂，本实验采用改良的大鼠在体鼻灌流模型考察丹酚酸B鼻腔吸收情况。
1 材料
Sartorius BT 125D电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；Techcomp CT15RT高速离心机(上海天美科学仪器厂)；DB-300电子蠕动泵(上海之信仪器有限公司)；FE20实验室oH计(上海梅特勒—托利多仪器有限公司)；LC-20A岛津高效液相色谱仪(四元泵，紫外检测器)。
丹酚酸B对照品(中国食品药品检定研究院，批号11562-201313，以97.0%计)；丹酚酸B提取物(上海源叶生物科技有限公司，批号115939-25-8，以95.0%计)；非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)；乳酸脱氢酶LDH活力定量测定试剂盒(普利莱基因技术有限公司)；磷酸二氢钠(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团)；其他试剂均为分析纯。
SD大鼠，雄性，体重(250±20)g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2012-0001。
2 方法与结果
2.1 丹酚酸B含量测定
2.1.1 色谱条件DiamonsilTM钻石C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相甲醇-乙腈-甲酸-水(30：7：1：62)，检测波长286nm，流速1.0mL·min-1，进样量10μL，柱温30℃，丹酚酸B出峰时间14.20min，该条件下，系统适应性良好，见图1。
2.1.2 线性关系考察 精密称取丹酚酸B对照品20.60mg，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并配制成对照品储备液。精密量取一定量的对照品储备液，用甲醇分别稀释为49.96，199.82，399.64，799.28，1498.65mg·L-1对照品溶液。在选定的色谱条件下，测定丹酚酸B的峰面积，以峰面积(4)对质量浓度(C)进行回归，标准曲线方程为A：13251C+15375，r=0.9995，丹酚酸B在49.96～1498.65mg·L-1与峰面积线性关系良好。
2.1.3 精密度考察 精密吸取同一对照品溶液，重复进样6次，峰面积的RSD为0.076%，表明仪器的精密度良好。
2.1.4 稳定性考察 以空白鼻灌流液分别配制低、中、高质量浓度(200，400，800mg·L-1)的丹酚酸B溶液，在4℃下放置不同时间(0，3，6，12，24h)后，15000r·min-1离心15min，吸取上清液进样，测定丹酚酸B的峰面积，其24h内RSD为1.0%，0.71%，0.72%，表明鼻灌流液中丹酚酸B在4℃下24h内稳定。
2.1.5 回收率考察 精密称取丹酚酸B对照品，以空白鼻灌流液分别配制低、中、高质量浓度的丹酚酸B溶液，15000r·min-1离心15min，吸取上清液进样测定，计算测得含量，与理论值进行比较计算回收率，结果显示回收率在95.0%～105%，说明该方法准确，结果见表1。
2.2 大鼠鼻腔循环灌流试验
2.2.1 动物模型的准备 体重(250±20)g，SD雄性大鼠，饲养1～3d，待其充分适应环境后，正常饮水，禁食12h。大鼠腹腔注射20%乌拉坦(1.0g·kg-1)麻醉，仰卧固定于鼠板上，于颈部切口暴露气管和食管。取聚乙烯管2支，一支插入气管，另一支的一端插入食管，直至鼻腔底部。用胶黏剂将鼻腔与口腔的鼻腭通道封闭，以防药液流入口腔，管子的另一端与蠕动泵硅胶管相接后，硅胶管另一端插入药液底部，启动蠕动泵使药液循环。
2.2.2 鼻腔灌流循环试验 循环液体积流量设为2.5mL·min-1。首先以生理盐水10mL循环10min，测定循环前后的生理盐水体积，若体积变化小于0.1mL则整个环路密封性良好，无漏液情况。排尽生理盐水后，取5mL药液置5mL量筒中，37℃水浴恒温，将蠕动泵进液管插入量筒底部，启动蠕动泵，待大鼠鼻中药液滴出时开始计时，设为0时，于0，10，20，30，45，60，90，120min读取量筒中剩余药液体积V后取样0.25mL，补加循环药液0.25mL，样品15000r·min-1高速离心15min，吸取上清液0.15mL，以HPLC进行测定各时间剩余药物浓度Cn。其中循环死体积为VD：=(5-V0)。剩余药量Qn采用体积校正法来计算。 (杜秋 杜守颖 李鹏跃 陆洋 白洁 滕会会 王振 张晴)