中华大蟾蜍皮肤Cathelicidin家族新型抗菌肽的鉴定及其抗菌活性(1)
[摘要]对中华大蟾蜍皮肤转录组进行了测定，通过对得到转录组数据的组装、注释和序列比对得到1个新型Cathelicidin家族前体cDNA。按照Cathelicidin家族抗菌肽的加工方式，推导出该前体可能编码2个成熟的中华大蟾蜍Cathelicidin家族抗菌肽，命名为BG-CATH25，BG-CATH29。圆二色散测定了合成BG-CATH25，BG-CATH29的二级结构特征，结果揭示BG-CATH25，BG-CATH29在不同缓冲体系中以无规则卷曲的构象为主。对实验所用4种细菌的抗菌活性研究表明BG-CATH25，BG-CATH29对嗜水气单胞菌有较强的抑菌活性，MIC分别为1.25，10 mg·L-1。
[关键词]中华大蟾蜍；Cathelicidin；抗菌肽；转录组；嗜水气单胞菌
[Abstract]The skin transcriptome of Bufu bufo gargarizans was determined by conventional methods. A novel full length cDNA coding for a Cathelicidin precursor was identified by transcriptomic data assembling， annotation and blast search of corresponding data banks. According to the known processing methods of Cathelicidin family members， present reported novel Cathelicidin precursor of B. bufo gargarizans might be cleaved at 2 possible sites of the same precursor and generate both BG-CATH25 and BG-CATH29 as mature molecules. The deduced BG-CATH25 and BG-CATH29 were synthesized with purity >95% to evaluate the properties and bactericidal activities. The secondary structural characteristics of both BG-CATH25 and BG-CATH29 in different solutions were determined by Circular Dichroism (CD) Analysis. CD results indicated that random coil conformation were the main structural elements for both BG-CATH25 and BG-CATH29 in different buffer systems. Antimicrobial activities against tested bacterial strains were carried out by plating method. Both BG-CATH25 and BG-CATH29 showed strong antibacterial activities against Aeromonas hydrophila， with MIC values of 1.25， 10 mg·L-1， respectively. However， both of them showed weak bactericidal activities against human pathogenic bacteria， like Escherichia coli (ATCC25922)，Staphylococcus aureus (ATCC25923)and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).
[Key words]Bufu bufo gargarizans； Cathelicidin； antimicrobial peptides； transcriptome； Aeromorus hydrophila
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的多肽，是先天免疫系统的重要组成部分，广泛存在于细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物以及人体内[1-2]。同时，抗菌肽的广谱抗菌性，杀菌活性强，并且对人体伤害小以及不易产生耐药性等优点，被认为是抗生素替代的首选药物，具有广阔的应用前景。而Cathelicidin家族是目前发现的一群具有广谱的抗菌活性和广泛的生物学功能的抗菌肽超家族的一员，有广泛的应用价值。近年来，Cathelicidin家族抗菌肽引起越来越广泛的重视[3]。
中华大蟾蜍Bufu bufo gargarizans是我国传统中药蟾酥的主要药用动物。作为传统中药材，蟾酥主要是中华大蟾蜍的皮肤分泌物的干燥产物。中华大蟾蜍皮肤对维持其自身生存和适应栖息地的多样化生态环境起着重要作用，能为其生存提供必须的功能。目前的研究表明蟾酥具有强心、抗心肌缺血、局麻、抗肿瘤、抗炎、镇痛等作用。蟾酥实现其生物学功能的分子基础是其中含有的化学成分，主要是蟾蜍二烯羟酸内酯类、蟾毒色胺类、甾醇类等[4-8]。比较而言，蟾蜍皮肤分泌液中所含有的蛋白质及肽类物质的研究开展较少。目前，以Cathelicidin家族为模板设计抗菌肽的研究正在兴起[9]。作者最近报道了首个中华大蟾蜍Cathelicidin家族抗菌肽的研究，揭示了中华大蟾蜍Cathelicidin家族抗菌肽BG-CATH37 和BG-CATH(5-37)针对其栖息环境微生物嗜水气单胞菌Aeromorus hydrophila、灿烂弧菌Vibrio splendidus和海豚链球菌Streptococcus iniae有较好的抗菌活性[10]。本文中，通过对测定转录组数据的进一步挖掘，发现了另外1条编码中华大蟾蜍Cathelicidin家族抗菌肽的cDNA。通过对已知的Cathelicidin家族的抗菌肽加工方式的分析，该前体cDNA可能产生成熟抗菌肽BG-CATH25和BG-CATH29。在此基础上，对合成BG-CATH25和BG-CATH29的理化性质和抗菌活性进行了研究，为不同缓冲体系中均以无规则卷曲的构象为主，并且在对4种细菌的抗菌活性中表现出对嗜水气单胞菌有较强的抑菌活性。 (展波 高媛媛 林维平 贾广韬 孙同毅 李文辉)
[关键词]中华大蟾蜍；Cathelicidin；抗菌肽；转录组；嗜水气单胞菌
[Abstract]The skin transcriptome of Bufu bufo gargarizans was determined by conventional methods. A novel full length cDNA coding for a Cathelicidin precursor was identified by transcriptomic data assembling， annotation and blast search of corresponding data banks. According to the known processing methods of Cathelicidin family members， present reported novel Cathelicidin precursor of B. bufo gargarizans might be cleaved at 2 possible sites of the same precursor and generate both BG-CATH25 and BG-CATH29 as mature molecules. The deduced BG-CATH25 and BG-CATH29 were synthesized with purity >95% to evaluate the properties and bactericidal activities. The secondary structural characteristics of both BG-CATH25 and BG-CATH29 in different solutions were determined by Circular Dichroism (CD) Analysis. CD results indicated that random coil conformation were the main structural elements for both BG-CATH25 and BG-CATH29 in different buffer systems. Antimicrobial activities against tested bacterial strains were carried out by plating method. Both BG-CATH25 and BG-CATH29 showed strong antibacterial activities against Aeromonas hydrophila， with MIC values of 1.25， 10 mg·L-1， respectively. However， both of them showed weak bactericidal activities against human pathogenic bacteria， like Escherichia coli (ATCC25922)，Staphylococcus aureus (ATCC25923)and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).
[Key words]Bufu bufo gargarizans； Cathelicidin； antimicrobial peptides； transcriptome； Aeromorus hydrophila
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的多肽，是先天免疫系统的重要组成部分，广泛存在于细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物以及人体内[1-2]。同时，抗菌肽的广谱抗菌性，杀菌活性强，并且对人体伤害小以及不易产生耐药性等优点，被认为是抗生素替代的首选药物，具有广阔的应用前景。而Cathelicidin家族是目前发现的一群具有广谱的抗菌活性和广泛的生物学功能的抗菌肽超家族的一员，有广泛的应用价值。近年来，Cathelicidin家族抗菌肽引起越来越广泛的重视[3]。
中华大蟾蜍Bufu bufo gargarizans是我国传统中药蟾酥的主要药用动物。作为传统中药材，蟾酥主要是中华大蟾蜍的皮肤分泌物的干燥产物。中华大蟾蜍皮肤对维持其自身生存和适应栖息地的多样化生态环境起着重要作用，能为其生存提供必须的功能。目前的研究表明蟾酥具有强心、抗心肌缺血、局麻、抗肿瘤、抗炎、镇痛等作用。蟾酥实现其生物学功能的分子基础是其中含有的化学成分，主要是蟾蜍二烯羟酸内酯类、蟾毒色胺类、甾醇类等[4-8]。比较而言，蟾蜍皮肤分泌液中所含有的蛋白质及肽类物质的研究开展较少。目前，以Cathelicidin家族为模板设计抗菌肽的研究正在兴起[9]。作者最近报道了首个中华大蟾蜍Cathelicidin家族抗菌肽的研究，揭示了中华大蟾蜍Cathelicidin家族抗菌肽BG-CATH37 和BG-CATH(5-37)针对其栖息环境微生物嗜水气单胞菌Aeromorus hydrophila、灿烂弧菌Vibrio splendidus和海豚链球菌Streptococcus iniae有较好的抗菌活性[10]。本文中，通过对测定转录组数据的进一步挖掘，发现了另外1条编码中华大蟾蜍Cathelicidin家族抗菌肽的cDNA。通过对已知的Cathelicidin家族的抗菌肽加工方式的分析，该前体cDNA可能产生成熟抗菌肽BG-CATH25和BG-CATH29。在此基础上，对合成BG-CATH25和BG-CATH29的理化性质和抗菌活性进行了研究，为不同缓冲体系中均以无规则卷曲的构象为主，并且在对4种细菌的抗菌活性中表现出对嗜水气单胞菌有较强的抑菌活性。 (展波 高媛媛 林维平 贾广韬 孙同毅 李文辉)