膜荚黄芪的转录组测序质量评估及其SSR位点信息分析的研究(1)
[摘要]该实验采用Roche 454 GS FLX测序仪获得黄芪的转录组数据，使用454 Sequencing System Software分析软件进行转录组从头拼接；利用MISA工具筛选了黄芪转录组测序获得的9 893条unigenes，对其SSR 位点信息进行了分析。结果表明，进行测序所得的reads的平均长度为413 bp，约86%的reads参与了拼接，拼接的N50长度为1 205 bp，所测得的unigene数量基本涵盖了全部转录组信息；黄芪转录组搜索到1 729个SSR位点，SSR的发生频率为924%，SSR在黄芪整个转录组中出现的频率为1342%，SSR的平均距离为797 kb。一共发现核心重复序列127种，占优势的是二核苷酸型中的TG/AC型，出现的频率占总SSR位点的425%。黄芪转录组的测序结果揭示了黄芪转录组的整体表达特征，并得到大量黄芪转录组unigene序列，并且黄芪转录组SSR位点出现频率高，类型多样，多态性潜能高。
[关键词]膜荚黄芪；转录组测序；SSR；位点信息
[Abstract]In this study， 454/Roche GS FLX sequencing technology was used to obtain the data of the Astragalus membranaceus Four hundred and fiftyfour Sequencing System Software was applied to carry out the transcription of the group from scratch Using MISA tools， 9 893 unigenes were selected for the sequence of the genome of A membranaceus， and the information of SSR locus was analyzed According to the result， the average length of reads was 413 bp， about 86% of the reads was involved in the splicing， the length of the N50 was 1 205 bp， the number of unigenes was measured by the whole transcript 1 729 SSR loci in the A membranaceus transcriptome were searched， the occurrence frequency of SSR was 924%， the frequency of SSR in the whole transcriptome was 1342%， the average length of SSR was 797 kbOne hundred and twentyseven kinds of core repeat sequences were found， the dominant type was TG/AC type of dinucleotide， it appeared to account for 425% of the total SSR locus The results of the sequence of the transcription of the A membranaceus transcriptome revealed the overall expression， and a large number of unigenessequence was obtained， and the SSR locus in the genome of the A membranaceus is high， and the type is diverse， and the polymorphism of the gene is high
[Key words]Astragalus membranaceus； transcriptome sequencing； SSR； information of loci
doi：10.4268/cjcmm20160810
中药材黄芪按《中国药典》(2010年版)规定，是蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch) Bgevarmongholicus Hsiao Bge或膜荚黄芪A membranaceus(Fisch) Bge的干燥根。味甘性温，具有补气升阳，健脾利尿，排毒排脓，敛疮生肌等功效[1]。转录组(transcriptome)是指特定细胞在某一功能状态下全部表达的基因总和，代表了每一个基因的身份和表达水平，转录组测序能全面的地揭示生物个体在特定组织和特定时期的全局基因的表达情况。简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)，一般以1～6个碱基为核心序列，具有高度多态性。目前已利用SSR 标记构建了许多物种的染色体遗传图谱，并被广泛应用于基因定位及亲缘关系分析、品种鉴定和动植物育种等领域[2]。本实验旨在完成黄芪转录组测序并分析其SSR位点信息，为黄芪进一步在遗传图谱构建、种质鉴定、遗传多样性分析等方面的研究奠定了基础。
1材料与方法
11植物
本试验所用膜荚黄芪种子，由黑龙江中医药大学试验中心马伟研究员鉴定。在黑龙江中医药大学药用植物园日光温室内无土栽培培养，选取苗龄40 d的黄芪。取材健康的根、茎、叶，采集后用液氮速冻后-80 ℃保存。
12植物总RNA的提取
黄芪总RNA提取参考改良的CTAB方法[3]，具体步骤如下：取适量植物材料于研钵中加入液氮研磨至粉末状；将粉末转移至20 mL离心管中，加入1 mL无水乙醇，充分振荡后，冰上放置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心2～5 min；小心弃掉上清，在离心管中加入900 μL CTAB提取液，振荡混匀后，65 ℃水浴5 min，放置冰上，加入等体积氯仿，4 ℃ 12 000 r·min-1离心5～10 min；小心吸取上清至新的离心管中，加入1/2体积无水乙醇及08体积5 mol·L-1LiCl，混匀，冰上放置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，弃上清；70%乙醇洗涤沉淀2次，室温放置5 min干燥RNA，加入50 μL灭菌水溶解RNA，-80 ℃备用。 (常越 闫嵩 刘振鹏 任伟超 刘玠 马伟)
[关键词]膜荚黄芪；转录组测序；SSR；位点信息
[Abstract]In this study， 454/Roche GS FLX sequencing technology was used to obtain the data of the Astragalus membranaceus Four hundred and fiftyfour Sequencing System Software was applied to carry out the transcription of the group from scratch Using MISA tools， 9 893 unigenes were selected for the sequence of the genome of A membranaceus， and the information of SSR locus was analyzed According to the result， the average length of reads was 413 bp， about 86% of the reads was involved in the splicing， the length of the N50 was 1 205 bp， the number of unigenes was measured by the whole transcript 1 729 SSR loci in the A membranaceus transcriptome were searched， the occurrence frequency of SSR was 924%， the frequency of SSR in the whole transcriptome was 1342%， the average length of SSR was 797 kbOne hundred and twentyseven kinds of core repeat sequences were found， the dominant type was TG/AC type of dinucleotide， it appeared to account for 425% of the total SSR locus The results of the sequence of the transcription of the A membranaceus transcriptome revealed the overall expression， and a large number of unigenessequence was obtained， and the SSR locus in the genome of the A membranaceus is high， and the type is diverse， and the polymorphism of the gene is high
[Key words]Astragalus membranaceus； transcriptome sequencing； SSR； information of loci
doi：10.4268/cjcmm20160810
中药材黄芪按《中国药典》(2010年版)规定，是蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch) Bgevarmongholicus Hsiao Bge或膜荚黄芪A membranaceus(Fisch) Bge的干燥根。味甘性温，具有补气升阳，健脾利尿，排毒排脓，敛疮生肌等功效[1]。转录组(transcriptome)是指特定细胞在某一功能状态下全部表达的基因总和，代表了每一个基因的身份和表达水平，转录组测序能全面的地揭示生物个体在特定组织和特定时期的全局基因的表达情况。简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)，一般以1～6个碱基为核心序列，具有高度多态性。目前已利用SSR 标记构建了许多物种的染色体遗传图谱，并被广泛应用于基因定位及亲缘关系分析、品种鉴定和动植物育种等领域[2]。本实验旨在完成黄芪转录组测序并分析其SSR位点信息，为黄芪进一步在遗传图谱构建、种质鉴定、遗传多样性分析等方面的研究奠定了基础。
1材料与方法
11植物
本试验所用膜荚黄芪种子，由黑龙江中医药大学试验中心马伟研究员鉴定。在黑龙江中医药大学药用植物园日光温室内无土栽培培养，选取苗龄40 d的黄芪。取材健康的根、茎、叶，采集后用液氮速冻后-80 ℃保存。
12植物总RNA的提取
黄芪总RNA提取参考改良的CTAB方法[3]，具体步骤如下：取适量植物材料于研钵中加入液氮研磨至粉末状；将粉末转移至20 mL离心管中，加入1 mL无水乙醇，充分振荡后，冰上放置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心2～5 min；小心弃掉上清，在离心管中加入900 μL CTAB提取液，振荡混匀后，65 ℃水浴5 min，放置冰上，加入等体积氯仿，4 ℃ 12 000 r·min-1离心5～10 min；小心吸取上清至新的离心管中，加入1/2体积无水乙醇及08体积5 mol·L-1LiCl，混匀，冰上放置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，弃上清；70%乙醇洗涤沉淀2次，室温放置5 min干燥RNA，加入50 μL灭菌水溶解RNA，-80 ℃备用。 (常越 闫嵩 刘振鹏 任伟超 刘玠 马伟)