不同基原虫草的成分比较及其对人胚胎成纤维细胞抗纤维化作用的初步研究(1)
[摘要]该研究以尿苷、腺苷、虫草素为主要评价指标，采用高效液相、液质联用等色谱方法，对6种不同基原的10个虫草样品的虫体/草体/全体进行高效液相/液质联用的测定和比对；并利用TGFβ1诱导人胚胎成纤维细胞CCCESF1建立体外细胞外基质聚集模型，观察不同基原虫草提取物的抗纤维化活性。实验结果显示，不同基原子实体和菌丝成分数量上基本相同，但是各成分的含量分布具有明显的差异；不同基原的虫草提取物中，体外抗纤维化活性结果为：虫草花>蝉虫草(金蝉花)>桑蚕蛹虫草>柞蚕蛹虫草>天然冬虫夏草。该研究结果为找寻天然冬虫夏草的人工替代品提供了科学的参考和依据。
[关键词]不同基原； 虫草； 人胚胎成纤维细胞； 抗纤维化活性
冬虫夏草Cordyceps sinensis是我国传统名贵滋补中药材之一，其营养成分高于人参，可入药，也可食用，具有很高的营养价值。冬虫夏草可以增强机体的免疫力，滋补肺肾，对肺癌、肝癌等有明显的抑制作用。在临床上对肺虚久咳、气喘、肺结核咯血、盗汗、肾虚腰膝酸痛、阳痿遗精、神经衰弱及化疗、放疗后的红细胞下降都有疗效。然而，由于自然条件的限制，资源紧缺，价格昂贵。为满足市场的需求，人们积极的找寻天然冬虫夏草的替代产品，如蛹虫草(又名北虫草、北冬虫夏草)子实体为麦角菌科虫草属真菌蛹草菌Cmilitaris (L) Link 的干燥子座，是虫草属的模式种，也是与冬虫夏草极为相似的种[1]。研究结果表明，蛹虫草子实体的活性成分与野生冬虫夏草类似，含有虫草素、腺苷、腺嘌呤、虫草酸、虫草多糖等[23]。其中虫草素和腺苷更被认为是虫草的主要活性成分[4]，虫草素具有抗病毒和肿瘤等作用[5]，腺苷具有改善心脑血液循环的作用[6]。目前人工培育的蛹虫草以柞蚕蛹虫草为主，此外还有桑蚕蛹虫草，以及人工培养基培育的虫草花和虫草菌丝体。桑蚕蛹虫草是采用蛹虫草菌通过人工接种在活的桑蚕蛹体上人工培养的子座；虫草花是采用蛹虫草菌接种在以大米、玉米等固体培养基上人工培养的子座；虫草菌丝体是从天然冬虫夏草提取菌株，然后在大容积的液体培养基里进行接种、培养、发酵得到的发酵产物。此外还有产于大别山区的蝉虫草(金蝉花)，也在民间广泛使用。
现代研究表明[79]，各种虫草替代品均含有较为接近的活性成分，因此被认为有着相似的保健功效。但不同基原虫草的全面成分和生物活性的比较研究，尤其是天然虫草与蛹虫草的子实体和菌丝中成分的比较研究还比较欠缺。
本课题组全面收集不同基原的虫草样品，包括：天然冬虫夏草、柞蚕蛹虫草、桑蚕蛹虫草、蝉虫草以及不同培养基培育的虫草花样品，利用高效液相色谱法建立并比对了虫体和草体的成分分布情况；取其中代表性样品进行提取，利用高效液相三重四级杆质谱联用技术对提取物成分进行了鉴定分析，选择虫草的主要药效活性之一——抗纤维化作用作为药效筛选指标，利用TGFβ1诱导人胚胎皮肤成纤维细胞CCCESF1建立细胞外基质聚集模型，对各个提取物进行了体外抗纤维化活性筛选。比较不同基原不同提取方法样品的成分与功效之间的关联性。为找寻天然虫草的最佳替代品，阐明成分与功效之间的关系，提供了理论依据。
1 材料
本实验采集不同基原及产地的虫草样品，所有样本均经过中国中医科学院中药研究所生物技术中心进行基因条形码鉴定认证，见表 1。
人胚胎成纤维细胞CCCESF1购自国家细胞资源平台，于 DMEM 培养基(含10% 胎牛血清) 中培养传代。
腺苷(国家食品药品检定研究院，纯度≥98%，编号1.10879200202)；酪氨酸(国家食品药品检定研究院，编号1.4062.4.200805)；尿苷(北京赛百草科技有限公司，纯度≥98%，SN201.3080407)；虫草素(纯度≥98%，由杨立新老师提供，用于定性鉴别)。
甲醇，色谱级(Fisher公司)；DMEM高糖培养基(Gibco公司)；胎牛血清 (FCS) (SigmaAldrich 公司)；ITS (insulintransferinselenium) (SigmaAldrich 公司)；PBS(phosphate buffer solution) (Gibco 公司)；005%胰蛋白酶消化液 (Gibco 公司)；人重组TGFβ1 (R&D Systems Europe公司)；天狼星红染料 (PSR) (SigmaAldrich 公司)；COLI 包被96 孔细胞培养板(BD bioscience公司)。
KQ2.50B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TAISITE DFD700 电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；SL20ADAD型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；双压线性离子阱串联高分辨质谱Orbitrap Velos Pro (Thermo Fisher 公司)；戴安 Ultimate3000 超高效液相色谱仪；Varioskan Flash 多功能酶标仪。梅特勒ML104 1/1万分析天平；色谱柱安谱 CNW C1.8WP (4.6 mm×2.50 mm，5 μm)。
2方法
2.1 虫草成分分布的HPLC测定
2.1.1 色谱条件[10]色谱柱为安谱 CNW C1.8WP (4.6 mm×2.50 mm，5 μm)；甲醇(A)水(B)，梯度洗脱，见表2；检测波长为2.60 nm；柱温为3.5 ℃；流速1 mL·min-1。理论板数按腺苷峰计算应不低于6 000，见图1。
A酪氨酸； B尿苷； C腺苷； D虫草素。
2.1.2对照品及供试品溶液的制备及测定①对照品溶液的制备：取腺苷、尿苷对照品适量，分别精密称定，腺苷和尿苷均为 40 mg·L-1的溶液，即得。虫草素样品同样配制成40 mg·L-1的溶液，用于定性。②供试品溶液制备：将天然虫草、蛹虫草和蝉虫草样品的虫体和草体剥离，分别粉碎过60目筛。取上述样品08 g，精密称定，置50 mL量瓶中加水4.5 mL，超声处理(功率2.50 W，频率40 kHz)4.5 min使溶解，放冷，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。③测定法：分别精密吸取参照物溶液5 μL与供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。 (司南 彭博 赵海誉 王宏洁 杨健 李建荣 孙伟 边宝林)
[关键词]不同基原； 虫草； 人胚胎成纤维细胞； 抗纤维化活性
冬虫夏草Cordyceps sinensis是我国传统名贵滋补中药材之一，其营养成分高于人参，可入药，也可食用，具有很高的营养价值。冬虫夏草可以增强机体的免疫力，滋补肺肾，对肺癌、肝癌等有明显的抑制作用。在临床上对肺虚久咳、气喘、肺结核咯血、盗汗、肾虚腰膝酸痛、阳痿遗精、神经衰弱及化疗、放疗后的红细胞下降都有疗效。然而，由于自然条件的限制，资源紧缺，价格昂贵。为满足市场的需求，人们积极的找寻天然冬虫夏草的替代产品，如蛹虫草(又名北虫草、北冬虫夏草)子实体为麦角菌科虫草属真菌蛹草菌Cmilitaris (L) Link 的干燥子座，是虫草属的模式种，也是与冬虫夏草极为相似的种[1]。研究结果表明，蛹虫草子实体的活性成分与野生冬虫夏草类似，含有虫草素、腺苷、腺嘌呤、虫草酸、虫草多糖等[23]。其中虫草素和腺苷更被认为是虫草的主要活性成分[4]，虫草素具有抗病毒和肿瘤等作用[5]，腺苷具有改善心脑血液循环的作用[6]。目前人工培育的蛹虫草以柞蚕蛹虫草为主，此外还有桑蚕蛹虫草，以及人工培养基培育的虫草花和虫草菌丝体。桑蚕蛹虫草是采用蛹虫草菌通过人工接种在活的桑蚕蛹体上人工培养的子座；虫草花是采用蛹虫草菌接种在以大米、玉米等固体培养基上人工培养的子座；虫草菌丝体是从天然冬虫夏草提取菌株，然后在大容积的液体培养基里进行接种、培养、发酵得到的发酵产物。此外还有产于大别山区的蝉虫草(金蝉花)，也在民间广泛使用。
现代研究表明[79]，各种虫草替代品均含有较为接近的活性成分，因此被认为有着相似的保健功效。但不同基原虫草的全面成分和生物活性的比较研究，尤其是天然虫草与蛹虫草的子实体和菌丝中成分的比较研究还比较欠缺。
本课题组全面收集不同基原的虫草样品，包括：天然冬虫夏草、柞蚕蛹虫草、桑蚕蛹虫草、蝉虫草以及不同培养基培育的虫草花样品，利用高效液相色谱法建立并比对了虫体和草体的成分分布情况；取其中代表性样品进行提取，利用高效液相三重四级杆质谱联用技术对提取物成分进行了鉴定分析，选择虫草的主要药效活性之一——抗纤维化作用作为药效筛选指标，利用TGFβ1诱导人胚胎皮肤成纤维细胞CCCESF1建立细胞外基质聚集模型，对各个提取物进行了体外抗纤维化活性筛选。比较不同基原不同提取方法样品的成分与功效之间的关联性。为找寻天然虫草的最佳替代品，阐明成分与功效之间的关系，提供了理论依据。
1 材料
本实验采集不同基原及产地的虫草样品，所有样本均经过中国中医科学院中药研究所生物技术中心进行基因条形码鉴定认证，见表 1。
人胚胎成纤维细胞CCCESF1购自国家细胞资源平台，于 DMEM 培养基(含10% 胎牛血清) 中培养传代。
腺苷(国家食品药品检定研究院，纯度≥98%，编号1.10879200202)；酪氨酸(国家食品药品检定研究院，编号1.4062.4.200805)；尿苷(北京赛百草科技有限公司，纯度≥98%，SN201.3080407)；虫草素(纯度≥98%，由杨立新老师提供，用于定性鉴别)。
甲醇，色谱级(Fisher公司)；DMEM高糖培养基(Gibco公司)；胎牛血清 (FCS) (SigmaAldrich 公司)；ITS (insulintransferinselenium) (SigmaAldrich 公司)；PBS(phosphate buffer solution) (Gibco 公司)；005%胰蛋白酶消化液 (Gibco 公司)；人重组TGFβ1 (R&D Systems Europe公司)；天狼星红染料 (PSR) (SigmaAldrich 公司)；COLI 包被96 孔细胞培养板(BD bioscience公司)。
KQ2.50B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TAISITE DFD700 电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；SL20ADAD型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；双压线性离子阱串联高分辨质谱Orbitrap Velos Pro (Thermo Fisher 公司)；戴安 Ultimate3000 超高效液相色谱仪；Varioskan Flash 多功能酶标仪。梅特勒ML104 1/1万分析天平；色谱柱安谱 CNW C1.8WP (4.6 mm×2.50 mm，5 μm)。
2方法
2.1 虫草成分分布的HPLC测定
2.1.1 色谱条件[10]色谱柱为安谱 CNW C1.8WP (4.6 mm×2.50 mm，5 μm)；甲醇(A)水(B)，梯度洗脱，见表2；检测波长为2.60 nm；柱温为3.5 ℃；流速1 mL·min-1。理论板数按腺苷峰计算应不低于6 000，见图1。
A酪氨酸； B尿苷； C腺苷； D虫草素。
2.1.2对照品及供试品溶液的制备及测定①对照品溶液的制备：取腺苷、尿苷对照品适量，分别精密称定，腺苷和尿苷均为 40 mg·L-1的溶液，即得。虫草素样品同样配制成40 mg·L-1的溶液，用于定性。②供试品溶液制备：将天然虫草、蛹虫草和蝉虫草样品的虫体和草体剥离，分别粉碎过60目筛。取上述样品08 g，精密称定，置50 mL量瓶中加水4.5 mL，超声处理(功率2.50 W，频率40 kHz)4.5 min使溶解，放冷，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。③测定法：分别精密吸取参照物溶液5 μL与供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。 (司南 彭博 赵海誉 王宏洁 杨健 李建荣 孙伟 边宝林)