中药化学成分透血脑屏障研究中MDCKpHaMDR细胞模型和操作规程的建立(2)

http://www.100md.com 2016年7月15日 《中国中药杂志》2016年第14期

     2.3细胞培养及传代MDCKpHaMDR细胞为贴壁生长细胞，自第2天起每天吸除旧的培养基，加入5 mL新鲜的完全DMEM20培养基。当细胞融合率到达80%～90%(3～4 d)时，倒掉旧培养基，以1 mL胰蛋白酶涮洗培养瓶去除残留血清对胰蛋白酶的抑制作用，再加入1 mL胰蛋白酶于3.7 ℃进行消化，显微镜下观察细胞突起收缩，即将变圆时立即翻转培养瓶，将胰蛋白酶去除，加入5 mL完全培养基，反复吹打贴附细胞的培养瓶底使细胞脱壁并分散，制成细胞悬液。吸取1 mL细胞悬液置于新的2.5 cm2培养瓶中，加入4 mL完全DMEM20培养基，在培养瓶上标记传代数，混匀后于5% CO₂，3.7 ℃恒温培养箱中继续培养。复苏细胞传代3～4代后，将DMEM20培养基换成DMEM10，培养至细胞融合率达到80%～90%后进入种板程序。

    2.4种板按照传代程序制备细胞悬液，用计数板计数，并用完全DMEM10培养基稀释至8×104～1×105个细胞·mL-1，备用。在1.2孔板的Transwell底端基底面先加入1.5 mL完全DMEM10培养基 ......