香砂六君子汤对菌致慢性萎缩性胃炎TLR信号通路的影响(2)
2.5 QPCR检测TLR2，TLR4信号通路相关基因mRNA的表达 液氮中取出组织块，研磨后加入Trizol裂解组织细胞，以获取的mRNA为模板逆转录为cDNA，对cDNA进行实时荧光定量PCR检测。以上操作均严格按照试剂盒说明书进行。各基因引物序列见表1。
2.6 Westernblot法检测TLR2，TLR4信号通路相关基因蛋白的表达 取100 mg组织块加入液氮充分研磨后，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心30 min取上清测蛋白浓度。其中，提取总蛋白用于检测βactin，pP38MAPK，P38MAPK，TLR2，TLR4蛋白的表达，提取细胞核用于NFκB，Histone H3蛋白的检测。配平蛋白体积和上样量后，经10%～12% SDS PAGE电泳，转膜至PVDF膜上，在3% BSA中封闭1 h，一抗(1∶1 000)稀释后4 ℃孵育过夜，洗膜后再用HRP耦联的二抗室温孵育1 h。洗膜后在暗室中加ECL发光液曝光。
2.7 硝酸还原酶法测定NO的含量 新鲜胃黏膜组织冰上匀浆，加入细胞与组织裂解液1 000 r·min-1离心20 min后取上清即可按照总一氧化氮检测试剂盒的说明书检测NO的含量 ......
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2.6 Westernblot法检测TLR2，TLR4信号通路相关基因蛋白的表达 取100 mg组织块加入液氮充分研磨后，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心30 min取上清测蛋白浓度。其中，提取总蛋白用于检测βactin，pP38MAPK，P38MAPK，TLR2，TLR4蛋白的表达，提取细胞核用于NFκB，Histone H3蛋白的检测。配平蛋白体积和上样量后，经10%～12% SDS PAGE电泳，转膜至PVDF膜上，在3% BSA中封闭1 h，一抗(1∶1 000)稀释后4 ℃孵育过夜，洗膜后再用HRP耦联的二抗室温孵育1 h。洗膜后在暗室中加ECL发光液曝光。
2.7 硝酸还原酶法测定NO的含量 新鲜胃黏膜组织冰上匀浆，加入细胞与组织裂解液1 000 r·min-1离心20 min后取上清即可按照总一氧化氮检测试剂盒的说明书检测NO的含量 ......
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