香砂六君子汤对菌致慢性萎缩性胃炎TLR信号通路的影响(1)
[摘要] 为研究香砂六君子汤对幽门螺杆菌相关性胃炎(HAG)大鼠的疗效及其对Toll样受体(Toll likereceptors，TLR)信号通路的影响。将60只清洁级的SD大鼠随机分为6组：正常对照组，模型组，香砂六君子汤组(低、中、高剂量3组)以及抑制剂(SB203580)组。通过采用幽门螺杆菌(HP)灌胃构建慢性萎缩性胃炎模型。组织病理检测胃黏膜组织的病变情况；ELISA检测TNFα，IL6含量以及iNOS的活性；硝酸还原酶法测定NO的含量；QPCR，Westernblot检测胃黏膜组织TLR2，TLR4，P38MAPK，NFκB基因的表达情况。结果显示，大鼠模型组与正常对照组相比，胃黏膜组织TLR2，TLR4，pP38MAPK蛋白以及细胞核内NFκB蛋白表达均增加(P<0.01)；与模型组相比，香砂六君子汤组大鼠胃黏膜TLR2，TLR4，pP38MAPK蛋白以及细胞核内NFκB蛋白表达逐渐降低，以高剂量组降低最为明显(P<0.01)，且HP根除率逐渐提高、慢性萎缩性胃炎的病理变化逐渐减轻。结果表明，在大鼠模型中，HP通过激活TLR2，TLR4/MAPK/NFκB/iNOS/NO信号通路诱发慢性萎缩性胃炎的病理改变，香砂六君子汤能根除HP，可减轻HP引起的慢性萎缩性胃炎的黏膜炎症反应。该中药方剂治疗HP所致的慢性萎缩性胃炎既安全又有效。
[关键词] 香砂六君子汤； 幽门螺杆菌； 慢性萎缩性胃炎； Toll样受体； 核因子kappa B； P38丝裂原活化蛋白激酶
慢性胃炎(chronic gastritis， CG)是因细菌、病毒感染或自身免疫性疾病等不同病因引起的各种慢性胃黏膜炎性病变，是一种常见病，其发病率在各种胃病中居首位。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori， HP)感染是其主要发病诱因之一[1]。香砂六君子汤源自《古今名医方论》，现代医学相关研究表明[2]，香砂六君子汤能抑制胃黏膜瘀血、水肿等病理变化，对胃黏膜损伤有促进自愈的疗效，可广泛应用于胃肠道疾病的治疗。其对慢性胃炎的治疗作用与抑制HP感染有关[34]，推断其对HP感染所导致的慢性胃炎可能具有非常理想的疗效。本研究利用HP所致慢性胃炎大鼠模型观察香砂六君子汤对菌致慢性胃炎治疗作用，并探讨其对TLR信号通路的影响，阐述其作用机制，以望为其临床治疗HP感染的慢性胃炎提供依据。
1 材料
清洁级SD大鼠60只，雌雄各半，体重约200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK(沪)20120002。大鼠饲养环境稳定，对实验动物的操作符合动物伦理学要求。菌种采用国际标准菌株幽门螺旋杆菌Hp ATCC 43504，浓度为1×109 cfu·mL-1的HP混悬液。
香砂六君子汤用人参6 g，白术12 g，茯苓12 g，甘草4.2 g，陈皮4.8 g，半夏6 g，木香4.2 g，砂仁4.8 g加工而成，药材由湖南中医药研究院提供。经作者鉴定后，统一由福建医科大学附属泉州第一医院药剂科使用煎药机煎制。
TLR2(172361AP)，TLR4(198111AP)，NFκB(107451AP)抗体购自美国proteintech公司；βactin(4967)，Histone H3(4499)，pP38MAPK(4511T)，P38MAPK(8690P)购自美国CST公司；诱导型一氧化氮合酶(NOS2)检测试剂盒，肿瘤坏死因子α(TNFα)检测试剂盒，白介素6(IL6)检测试剂盒均购自武汉优尔生公司；总一氧化氮检测试剂盒，细胞与组织裂解液，细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒均购自碧云天生物技术公司；SB203580，货号S83071MG(Sigma公司，美国)；Trizol试剂(Takara公司，日本)；逆转录试剂盒，货号RR047A(Takara公司，日本)；荧光定量PCR试剂盒，货号DRR820A(Takara公司，日本)。
移液器，台式超速离心机(Eppendorf公司，德国)；Multiskan MK3酶标仪(Thermo公司，美国)；ViiA 7实时荧光定量PCR扩增仪(ABI公司，美国)；垂直电泳仪，转膜仪(BioRad公司，美国)。
2 方法
2.1 分组与造模 将60只SD大鼠随机分为正常对照组，模型组，香砂六君子汤组(低、中、高剂量3组)以及抑制剂组。每组10只，雌雄各半。除正常对照组行生理盐水灌胃外，对其余各组别大鼠采用CagA+标准菌株进行空腹灌胃。HP混悬液剂量1.5 mL/只，隔日1 次，共3 次。灌胃前24 h禁食，灌胃后4 h正常进食。HP感染定植2周后，每组随机选取2只大鼠处死后进行胃黏膜组织的病理切片以及HP培养。
2.2 给药及取样 确认造模成功后，对除正常对照组外的各组大鼠行相应的给药处理。各种药物灌胃体积按每只15 mL·kg-1计算。香砂六君子汤组低、中、高剂量含生药分别为0.324，0.648，1.296 g·kg-1，每天2次，共给药4周；SB203580给药量10 mg·kg-1，每3 d 1次，共给药4周；正常对照组给予相应剂量的生理盐水。给药完毕后，颈椎脱臼处死大鼠，摘去眼球取血。同时，留取新鲜胃黏膜组织，部分置于液氮中保存，余样置甲醛固定后送病理检查。
2.3 HP培养及鉴定 HP在37 ℃微需氧环境中培养(5%O2，10%CO2，85%N2)，用接种环做分段分离，接种后观察分离效果，阳性者进行传代增菌。通过观察菌落形态，革兰染色以及尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶试验进行菌株鉴定。氯化三苯四氮唑试验菌落呈现金属光泽，革兰染色阴性、尿素酶实验阳性、过氧化氢酶实验阳性、氧化酶实验阳性，以上全部符合者为HP阳性。培养基采用布氏琼脂双相培养基。相关工作由医院检验科协助完成。
2.4 ELISA检测TNFα，IL6含量以及iNOS的活性 取血后1 000 r·min-1离心20 min，取上清即可检测TNFα，IL6。新鲜胃黏膜组织冰上匀浆，制备好的匀浆液于 5 000 r·min-1离心5 min后取上清即可检测iNOS。严格按照ELISA试剂盒的说明书进行后续操作。 (林志强 王大璇 洪珊珊 傅新阳)
[关键词] 香砂六君子汤； 幽门螺杆菌； 慢性萎缩性胃炎； Toll样受体； 核因子kappa B； P38丝裂原活化蛋白激酶
慢性胃炎(chronic gastritis， CG)是因细菌、病毒感染或自身免疫性疾病等不同病因引起的各种慢性胃黏膜炎性病变，是一种常见病，其发病率在各种胃病中居首位。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori， HP)感染是其主要发病诱因之一[1]。香砂六君子汤源自《古今名医方论》，现代医学相关研究表明[2]，香砂六君子汤能抑制胃黏膜瘀血、水肿等病理变化，对胃黏膜损伤有促进自愈的疗效，可广泛应用于胃肠道疾病的治疗。其对慢性胃炎的治疗作用与抑制HP感染有关[34]，推断其对HP感染所导致的慢性胃炎可能具有非常理想的疗效。本研究利用HP所致慢性胃炎大鼠模型观察香砂六君子汤对菌致慢性胃炎治疗作用，并探讨其对TLR信号通路的影响，阐述其作用机制，以望为其临床治疗HP感染的慢性胃炎提供依据。
1 材料
清洁级SD大鼠60只，雌雄各半，体重约200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK(沪)20120002。大鼠饲养环境稳定，对实验动物的操作符合动物伦理学要求。菌种采用国际标准菌株幽门螺旋杆菌Hp ATCC 43504，浓度为1×109 cfu·mL-1的HP混悬液。
香砂六君子汤用人参6 g，白术12 g，茯苓12 g，甘草4.2 g，陈皮4.8 g，半夏6 g，木香4.2 g，砂仁4.8 g加工而成，药材由湖南中医药研究院提供。经作者鉴定后，统一由福建医科大学附属泉州第一医院药剂科使用煎药机煎制。
TLR2(172361AP)，TLR4(198111AP)，NFκB(107451AP)抗体购自美国proteintech公司；βactin(4967)，Histone H3(4499)，pP38MAPK(4511T)，P38MAPK(8690P)购自美国CST公司；诱导型一氧化氮合酶(NOS2)检测试剂盒，肿瘤坏死因子α(TNFα)检测试剂盒，白介素6(IL6)检测试剂盒均购自武汉优尔生公司；总一氧化氮检测试剂盒，细胞与组织裂解液，细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒均购自碧云天生物技术公司；SB203580，货号S83071MG(Sigma公司，美国)；Trizol试剂(Takara公司，日本)；逆转录试剂盒，货号RR047A(Takara公司，日本)；荧光定量PCR试剂盒，货号DRR820A(Takara公司，日本)。
移液器，台式超速离心机(Eppendorf公司，德国)；Multiskan MK3酶标仪(Thermo公司，美国)；ViiA 7实时荧光定量PCR扩增仪(ABI公司，美国)；垂直电泳仪，转膜仪(BioRad公司，美国)。
2 方法
2.1 分组与造模 将60只SD大鼠随机分为正常对照组，模型组，香砂六君子汤组(低、中、高剂量3组)以及抑制剂组。每组10只，雌雄各半。除正常对照组行生理盐水灌胃外，对其余各组别大鼠采用CagA+标准菌株进行空腹灌胃。HP混悬液剂量1.5 mL/只，隔日1 次，共3 次。灌胃前24 h禁食，灌胃后4 h正常进食。HP感染定植2周后，每组随机选取2只大鼠处死后进行胃黏膜组织的病理切片以及HP培养。
2.2 给药及取样 确认造模成功后，对除正常对照组外的各组大鼠行相应的给药处理。各种药物灌胃体积按每只15 mL·kg-1计算。香砂六君子汤组低、中、高剂量含生药分别为0.324，0.648，1.296 g·kg-1，每天2次，共给药4周；SB203580给药量10 mg·kg-1，每3 d 1次，共给药4周；正常对照组给予相应剂量的生理盐水。给药完毕后，颈椎脱臼处死大鼠，摘去眼球取血。同时，留取新鲜胃黏膜组织，部分置于液氮中保存，余样置甲醛固定后送病理检查。
2.3 HP培养及鉴定 HP在37 ℃微需氧环境中培养(5%O2，10%CO2，85%N2)，用接种环做分段分离，接种后观察分离效果，阳性者进行传代增菌。通过观察菌落形态，革兰染色以及尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶试验进行菌株鉴定。氯化三苯四氮唑试验菌落呈现金属光泽，革兰染色阴性、尿素酶实验阳性、过氧化氢酶实验阳性、氧化酶实验阳性，以上全部符合者为HP阳性。培养基采用布氏琼脂双相培养基。相关工作由医院检验科协助完成。
2.4 ELISA检测TNFα，IL6含量以及iNOS的活性 取血后1 000 r·min-1离心20 min，取上清即可检测TNFα，IL6。新鲜胃黏膜组织冰上匀浆，制备好的匀浆液于 5 000 r·min-1离心5 min后取上清即可检测iNOS。严格按照ELISA试剂盒的说明书进行后续操作。 (林志强 王大璇 洪珊珊 傅新阳)