天然产物生物合成途径解析策略(3)
3 候选基因功能验证
通过基因共表达分析和基因簇发掘可以有效缩小候选基因的范围，减少候选基因功能验证的工作量。由于天然产物的结构千差万别导致其合成途径中的酶具有丰富的多样性，因此针对每一个酶的功能验证实验都具有一定的独特性。候选基因的功能验证需要综合运用分子生物学和分析化学等实验技术，是天然产物合成途径解析中最关键也是最具有挑战性的一步。
3.1 异源表达及酶活性检测 将候选基因在异源表达系统中进行表达，成功表达的酶蛋白可以催化内源性或外源性底物生成产物，通过LCMS或GCMS等技术对产物进行分析鉴定，从而确定酶的催化活性[1518]。目前常用于候选基因功能验证的异源表达系统包括大肠杆菌、酵母、拟南芥和烟草等。
由于具有遗传背景清晰、培养周期短、操作技术简单等特点，使得大肠杆菌成为应用最广泛的原核表达系统[1923]，一些天然产物合成相关的酶可以成功地在大肠杆菌中进行表达和鉴定，例如紫杉醇侧链的酰基转移酶。紫杉醇属于二萜类化合物，是销量最大的抗肿瘤天然药物。紫杉醇除了含有一个三环紫杉烷的核心结构外，还具有由酰氧基组成的侧链，而酰基转移酶是紫杉醇侧链形成的重要酶类 ......
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通过基因共表达分析和基因簇发掘可以有效缩小候选基因的范围，减少候选基因功能验证的工作量。由于天然产物的结构千差万别导致其合成途径中的酶具有丰富的多样性，因此针对每一个酶的功能验证实验都具有一定的独特性。候选基因的功能验证需要综合运用分子生物学和分析化学等实验技术，是天然产物合成途径解析中最关键也是最具有挑战性的一步。
3.1 异源表达及酶活性检测 将候选基因在异源表达系统中进行表达，成功表达的酶蛋白可以催化内源性或外源性底物生成产物，通过LCMS或GCMS等技术对产物进行分析鉴定，从而确定酶的催化活性[1518]。目前常用于候选基因功能验证的异源表达系统包括大肠杆菌、酵母、拟南芥和烟草等。
由于具有遗传背景清晰、培养周期短、操作技术简单等特点，使得大肠杆菌成为应用最广泛的原核表达系统[1923]，一些天然产物合成相关的酶可以成功地在大肠杆菌中进行表达和鉴定，例如紫杉醇侧链的酰基转移酶。紫杉醇属于二萜类化合物，是销量最大的抗肿瘤天然药物。紫杉醇除了含有一个三环紫杉烷的核心结构外，还具有由酰氧基组成的侧链，而酰基转移酶是紫杉醇侧链形成的重要酶类 ......
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