中药肝毒性研究方法技术的新进展及其应用(1)
[摘要]中药肝毒性问题受到了日益广泛的重视。目前，肝细胞系、亚细胞、三维培养、模式动物等体内体外模型在中药肝毒性的筛选中发挥着重要作用。随着现代系统观和整体论的引入，基因组学、蛋白质组学、代谢组学以及网络毒理学等新方法开始逐步应用于中药肝毒性标志物挖掘和肝毒性预警等方面。该文通过总结近年来中药肝毒性研究领域的成果，分析和探討其中存在的主要问题，提出具有中医药特色的“结合病/证模型和网络毒理学的中药量效毒关系研究”的新思路，同时也对该课题组开展的淫羊藿潜在肝毒性的初步研究进行了概述，希望能为中药肝毒性的评价方法和技术指导原则提供理论基础，推动中药肝毒性研究体系的发展与完善。
[关键词]中药肝毒性；病/证模型；量效毒；网络毒理学；淫羊藿
肝脏是人体最大的“加工厂”，承担着生物合成、代谢转化以及分泌排泄等重要功能。药物进入体循环后，将经过肝脏代谢，因此肝脏是药源性损伤的主要靶器官之一。北京大学第一医院王贵强教授[1]指出，403%的药物性肝损伤为中草药所致。何首乌、菊三七、补骨脂、番泻叶、大黄等临床常用中药都已经被证实具有一定的肝毒性，重视中药肝毒性已是当务之急。
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2010年版《中国药典》一部收载了中药材及饮片2 165种，其中标有毒性的只有83种，其中大毒10种，有毒42种，小毒31种。值得注意的是，本草古籍中提到的“毒”几乎全部指的是急性毒性；古人对于药物的慢性毒性认识，是一个薄弱环节，不过这也是由时代的局限性所导致的。现阶段临床上治疗心脑血管疾病和骨质疏松等疾病的中成药都需要长期服药，这势必对中药的安全性评价提出了更高的要求。因此，有必要对部分典型中药的安全性进行再评价，对中药的急性毒性、亚慢性毒性以及长期毒性有一个更为客观和科学的认识，明确其临床使用的安全窗；建立符合中医药特点的毒性评价体系，为中药的临床用药提供参考。
传统的毒理学研究通常以动物模型作为基础，实验周期较长，成本颇高。国际上常规的毒理学研究终点均因灵敏性、稳定性和特异性较差无法成为肝毒性早期诊断的标准。现有的临床前体外实验和体内实验的整体毒性预测率只有71%，有近30%的药物毒性是现有的临床前实验方法无法预测的。而随着分子生物学和现代分析技术的发展，越来越多的新技术和新模型已用于肝毒性的研究中，如干细胞诱导分化的肝细胞及亚细胞模型(快速、经济、直观地反映出药物对细胞及细胞器的影响)，斑马鱼模型(检测药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄过程)，三维培养模型(模拟肝脏细胞的空间结构并维持代谢酶的活性)，毒理基因组学，毒理蛋白质组学(利用基因芯片和质谱联用技术找出新的生物标记物，构建肝毒性数据库)，以上肝毒性检测手段的涌现极大的丰富了中药肝毒性评价体系的内涵，有助于进一步揭示中药肝毒性的机制，从而实现中药肝毒性的早期预警。鉴于此，笔者将针对近5年来国内外肝毒性研究体系的进展进行综述和分析。
, 百拇医药
1中药肝毒性评价的新模型及其应用
11常见的肝毒性评价细胞模型
常见的肝毒性筛选细胞系主要有人原代肝细胞，HepG2，L02，hiHeps，HepaRG细胞系等(表1)。HepG2细胞是最具有代表性和最常用的细胞系，细胞表面表达有丰富的IGFII受体，但是在标准培养条件下，细胞中功能性CYP450酶活很低，几乎检测不到。赵筱萍等[2]采用二乙酸荧光素荧光标记法在HepG2细胞模型上筛选木香中的肝毒性组分，结合GCMS联用技术，发现木香中所含的去氢木香内酯、珊塔玛内酯、瑞诺木烯内酯、α木香醇和榄香醇具有一定的肝毒性；L02细胞是一种正常人胚胎肝细胞，能够传代培养，常用作化合物肝脏毒性的体外研究模型。Lin等[3]通过测定L02细胞的活力，LDH渗漏率，酶活力，并结合UPLCQTOFMS技术，辨析出何首乌的肝毒性主要和蒽醌类以及大黄素等密切相关；hiHeps细胞是由人胚胎成纤维细胞分化而来，CYP3A4，CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9等代谢酶的活力和新鲜分离的肝原代细胞接近[4]；HepaRG细胞由人肝脏细胞分化而来，兼具肝细胞和胆管上皮细胞的特性，功能酶(CYP450酶，内质网酶，ABC转运蛋白)相对完整，具有双向分化能力。吴宇等[5]运用6种联合探针标记HepaRG细胞，双氯芬酸钠、盐酸丁螺环酮等药物的毒性充分体现，氧化应激、线粒体损伤、内质网应激以及钙稳态等指标的灵敏度也高于hiHeps，HepG2和L02细胞，提示HepaRG可作为高内涵细胞组学体外模型进行药物肝毒性筛选。
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12干细胞诱导分化的肝细胞模型
121人胚胎干细胞模型由人胚胎干细胞诱导分化的肝细胞(human embryonic stem cellderived hepatocytes，hESCHep)建立的肝毒性评价体系，具有实验周期短、用药量少和有效避免种属差异等优点。hESC诱导分化3周即形成均一的、纯度较高的肝样细胞，具有肝细胞典型的形态结构并且可以检测到CYP450酶、有机阴离子转运多肽1B1、消除转运蛋白BSEP以及肝细胞特异性蛋白，如胞内酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和分泌白蛋白等的表达[67]。目前，该技术仅被少数实验室掌握，价格不菲，但其为肝毒性评价体系的完善提供了一个全新的方向。
122人多潜能干细胞模型诱导人多潜能干细胞分化成肝细胞(human induced pluripotent stem cellsderived hepatocytes，hiPSCHep)，用凝胶固定培养，并将其与鼠胚胎成纤维细胞(3T3J2)、基质胶共培养建立微型图像化共培养平台(iMPCC)，该体系可促进hiPSCHep的成熟并使其寿命延长至4周。hiPSCHep可应用于肝毒性的预测以及肝极性、白蛋白含量、P450酶活的检测[8]。Sullivan团队[9]诱导hiPSCs分化出具有肝脏功能的人肝内胚层，发现其可以用于药物毒性的筛选，以及CYP1A2和CYP3A4酶活的研究。Takayama等[10]建立了hiPSCHep的三维球体培养体系(3D hiPSCHep)，采用WST8法检测肝毒性药物对细胞活力的影响，氯氮平、硝苯呋海因、他克林等药物作用后，3D hiPSCHep组的细胞活力均明显低于3D HepG2组，提示该模型的灵敏度要优于3D HepG2模型，更适用于肝毒性的早期筛选。, 百拇医药(宋捷 钟荣玲 夏智 吴豪 仲青香 张振海 韦英杰 石子琪 封亮 贾晓)
[关键词]中药肝毒性；病/证模型；量效毒；网络毒理学；淫羊藿
肝脏是人体最大的“加工厂”，承担着生物合成、代谢转化以及分泌排泄等重要功能。药物进入体循环后，将经过肝脏代谢，因此肝脏是药源性损伤的主要靶器官之一。北京大学第一医院王贵强教授[1]指出，403%的药物性肝损伤为中草药所致。何首乌、菊三七、补骨脂、番泻叶、大黄等临床常用中药都已经被证实具有一定的肝毒性，重视中药肝毒性已是当务之急。
, http://www.100md.com
2010年版《中国药典》一部收载了中药材及饮片2 165种，其中标有毒性的只有83种，其中大毒10种，有毒42种，小毒31种。值得注意的是，本草古籍中提到的“毒”几乎全部指的是急性毒性；古人对于药物的慢性毒性认识，是一个薄弱环节，不过这也是由时代的局限性所导致的。现阶段临床上治疗心脑血管疾病和骨质疏松等疾病的中成药都需要长期服药，这势必对中药的安全性评价提出了更高的要求。因此，有必要对部分典型中药的安全性进行再评价，对中药的急性毒性、亚慢性毒性以及长期毒性有一个更为客观和科学的认识，明确其临床使用的安全窗；建立符合中医药特点的毒性评价体系，为中药的临床用药提供参考。
传统的毒理学研究通常以动物模型作为基础，实验周期较长，成本颇高。国际上常规的毒理学研究终点均因灵敏性、稳定性和特异性较差无法成为肝毒性早期诊断的标准。现有的临床前体外实验和体内实验的整体毒性预测率只有71%，有近30%的药物毒性是现有的临床前实验方法无法预测的。而随着分子生物学和现代分析技术的发展，越来越多的新技术和新模型已用于肝毒性的研究中，如干细胞诱导分化的肝细胞及亚细胞模型(快速、经济、直观地反映出药物对细胞及细胞器的影响)，斑马鱼模型(检测药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄过程)，三维培养模型(模拟肝脏细胞的空间结构并维持代谢酶的活性)，毒理基因组学，毒理蛋白质组学(利用基因芯片和质谱联用技术找出新的生物标记物，构建肝毒性数据库)，以上肝毒性检测手段的涌现极大的丰富了中药肝毒性评价体系的内涵，有助于进一步揭示中药肝毒性的机制，从而实现中药肝毒性的早期预警。鉴于此，笔者将针对近5年来国内外肝毒性研究体系的进展进行综述和分析。
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1中药肝毒性评价的新模型及其应用
11常见的肝毒性评价细胞模型
常见的肝毒性筛选细胞系主要有人原代肝细胞，HepG2，L02，hiHeps，HepaRG细胞系等(表1)。HepG2细胞是最具有代表性和最常用的细胞系，细胞表面表达有丰富的IGFII受体，但是在标准培养条件下，细胞中功能性CYP450酶活很低，几乎检测不到。赵筱萍等[2]采用二乙酸荧光素荧光标记法在HepG2细胞模型上筛选木香中的肝毒性组分，结合GCMS联用技术，发现木香中所含的去氢木香内酯、珊塔玛内酯、瑞诺木烯内酯、α木香醇和榄香醇具有一定的肝毒性；L02细胞是一种正常人胚胎肝细胞，能够传代培养，常用作化合物肝脏毒性的体外研究模型。Lin等[3]通过测定L02细胞的活力，LDH渗漏率，酶活力，并结合UPLCQTOFMS技术，辨析出何首乌的肝毒性主要和蒽醌类以及大黄素等密切相关；hiHeps细胞是由人胚胎成纤维细胞分化而来，CYP3A4，CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9等代谢酶的活力和新鲜分离的肝原代细胞接近[4]；HepaRG细胞由人肝脏细胞分化而来，兼具肝细胞和胆管上皮细胞的特性，功能酶(CYP450酶，内质网酶，ABC转运蛋白)相对完整，具有双向分化能力。吴宇等[5]运用6种联合探针标记HepaRG细胞，双氯芬酸钠、盐酸丁螺环酮等药物的毒性充分体现，氧化应激、线粒体损伤、内质网应激以及钙稳态等指标的灵敏度也高于hiHeps，HepG2和L02细胞，提示HepaRG可作为高内涵细胞组学体外模型进行药物肝毒性筛选。
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12干细胞诱导分化的肝细胞模型
121人胚胎干细胞模型由人胚胎干细胞诱导分化的肝细胞(human embryonic stem cellderived hepatocytes，hESCHep)建立的肝毒性评价体系，具有实验周期短、用药量少和有效避免种属差异等优点。hESC诱导分化3周即形成均一的、纯度较高的肝样细胞，具有肝细胞典型的形态结构并且可以检测到CYP450酶、有机阴离子转运多肽1B1、消除转运蛋白BSEP以及肝细胞特异性蛋白，如胞内酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和分泌白蛋白等的表达[67]。目前，该技术仅被少数实验室掌握，价格不菲，但其为肝毒性评价体系的完善提供了一个全新的方向。
122人多潜能干细胞模型诱导人多潜能干细胞分化成肝细胞(human induced pluripotent stem cellsderived hepatocytes，hiPSCHep)，用凝胶固定培养，并将其与鼠胚胎成纤维细胞(3T3J2)、基质胶共培养建立微型图像化共培养平台(iMPCC)，该体系可促进hiPSCHep的成熟并使其寿命延长至4周。hiPSCHep可应用于肝毒性的预测以及肝极性、白蛋白含量、P450酶活的检测[8]。Sullivan团队[9]诱导hiPSCs分化出具有肝脏功能的人肝内胚层，发现其可以用于药物毒性的筛选，以及CYP1A2和CYP3A4酶活的研究。Takayama等[10]建立了hiPSCHep的三维球体培养体系(3D hiPSCHep)，采用WST8法检测肝毒性药物对细胞活力的影响，氯氮平、硝苯呋海因、他克林等药物作用后，3D hiPSCHep组的细胞活力均明显低于3D HepG2组，提示该模型的灵敏度要优于3D HepG2模型，更适用于肝毒性的早期筛选。, 百拇医药(宋捷 钟荣玲 夏智 吴豪 仲青香 张振海 韦英杰 石子琪 封亮 贾晓)