药用植物DNA标记辅助育种(一)：三七抗病品种选育研究(1)
[摘要]药用植物DNA标记辅助育种以DNA多态性为基础，依据分子杂交、聚合酶链式反应、高通量测序等技术，筛选与高产、优质、抗逆等表型关联的DNA片段作为标记，辅助新品种的选育。该研究采用DNA标记辅助育种结合系统选育的技术，选育首个三七抗病新品种“苗乡抗七1号”。结果表明，基于RADSeq技术检测出抗病品种包含12个特异SNP位点，经验证record_519688位点与三七抗根腐病相关，包含此位点的基因片段可作为抗病品种的遗传标记辅助三七系统选育；与常规栽培种相比，抗病品种种苗根腐病及锈腐病的发病率分别下降836%，718%；二年生及三年生三七根腐病的发病率分别下降436%，629%。此外，依据与抗病关联的SNP筛选三七潜在的抗病群体，该模式扩大目标群体并提高选育效率。药用植物DNA标记辅助育种将加快药用植物新品种选育及推广的进程，保障中药材产业健康发展。
[关键词]药用植物； DNA标记辅助育种； 三七； 连作障碍； 抗病品种；简化基因组测序技术； 单核苷酸多态性
, http://www.100md.com
药用植物传统育种主要依赖于植物的表型选择，一个优良品种的培育往往需要花费几年甚至十几年的时间，如何提高育种效率，是育种的关键。基因型与环境间互作等多重因素会影响表型选择效率，现代分子生物技术可加快药用植物育种进程，而且缩短育种周期，其中药用植物DNA标记辅助育种以DNA多态性为基础，依据分子杂交、聚合酶链式反应、高通量测序等技术，筛选与高产、优质、抗逆等表型相联的DNA片段作为标记，辅助新品种的选育，该技术可应用于遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源遗传多样性、分子标记辅助选择等方面。随着测序成本的降低，已经陆续在中草药开展了转录组、全基因组测序，这些序列信息提供了大量的SSR和SNP等分子标记，有利于高密度遗传图谱和物理图谱的构建，高密度图谱加速了分子标记与优良性状之间的连锁研究，为发掘植物抗逆及参与有效成分合成途径的新基因提供了许多线索和启示，提高了选育的效率。陈士林等首次提出“Herbgenomics”的概念，该学科涉及中草药结构基因组、功能基因组、基因组辅助育种、中草药蛋白质组学、中草药宏基因等内容，并阐明本草基因组学将加速药用植物优良品种的选育并促进绿色中药农业的科学化和规模化发展[12]。
, 百拇医药
本文以三七Panax notoginseng(Burk)FH Chen为例，介绍了药用植物依据DNA多态性为基础，利用高通量测序技术筛选与抗病相关联的SNP标记，辅助三七抗病新品种的选育。三七是五加科人参属植物，其性温、味甘、微苦，具有散瘀止血、消肿定痛的功能，是片仔癀、云南白药、复方三七口服液等常见中药制剂的主要原料之一[3]。三七在心脑血管方面的独特疗效越来越被人们所认可，其需求量逐年增加。为满足日益增长的需求，三七已经开展了系统的栽培技术研究，形成了较为规范的GAP技术体系[4]。然而三七为典型的生态脆弱型阴生植物，其分布区域较窄，连作障碍等问题严重[56]。三七的人工栽培过程中病虫害比较严重，例如根结线虫病害显著抑制了三七块根的生长，抑制率高达30%以上[7]；三七种植导致根际土壤微生物多样性及组成的变化，随着其种植年限增加根腐病致病菌Fusarum oxysporum的丰度显著增加[8]。在病害防治过程中，高毒农药的投入破坏了三七田间生态系统，并造成三七农残及重金属超标。而三七不同栽培品种的抗病性存在显著性差异，选育抗病性品种可获得性状优良、抗逆性强的三七群体植株，有效的减少农药的使用量[911]。抗病新品种的选育是保障三七产业可持续发展的策略之一。
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系统选育是三七遗传改良的方式之一，也是三七育种的重要手段。孫玉琴等对三七植株性状差异进行比较，结果表明三七植株的茎、块根、休眠芽、花序、叶、果实存在明显变异，为三七育种工作提供了依据[12]。通过对三七不同变异类型中皂苷含量的比较分析，确定将紫根、复叶柄平展型、长形根、宽叶4种类型作为三七品种选育的目标[13]。然而系统选育育种周期长，受环境影响较大，在短时间内选择优良性状难度极大。采用DNA标记辅助三七新品种的选育，该方法不仅准确性高，而且缩短育种周期。本研究利用高通量测序技术检测抗病群体中的SNP位点，结合PCR技术筛选与三七抗病关联的DNA片段，以此基因片段作为标记辅助系统选育，并利用该关联基因片段筛选潜在的抗病群体。该模式可加快新品种选育及推广的进程，为中药材可持续发展提供思路及策略。
1材料与方法
11三七DNA标记辅助新品种选育流程从文山周边收集抗病单株并播种于云南文山三七科技示范园的试验田，该试验田为三七连作5年病圃。采集病圃中存活三七单株的种子，建立抗病群体；采用简化基因组测序技术(restrictionsite associated dna sequencing，RADSeq) 结合PCR技术筛选抗病群体的关联SNP位点，辅助三七新品种的系统选育；通过淘汰非目标性状，分离和纯化抗病群体，选育三七抗病新品种，三七DNA标记辅助选育流程见图1。
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12SNP位点分析采用高通量测序技术筛选抗病植株特异的SNP位点，阐述其特异性。分别采集30株抗病及感根腐病三七植株，采用HiSeq PE150测序，有效数据用于分析寻找SNP标记。测序流程为：利用多种限制性内切酶对该物种DNA分别进行酶切，根据酶切实验的结果选择合适的酶进行后续实验；质检合格的DNA样品，采用RAD建库方式构建长度范围在300～500 bp的pairend文库；Illumina HiSeq PE150测序，有效数据用于分析寻找海量SNP标记。
首先，对每个样品中的RADtag进行比对归类，按照每类tag的深度信息由大到小进行排序，得到每个个体的RADtag频数表[14]。每个样品的RADtag内部进行比对得到样品内部的杂合位点信息。不同样品之间的RADtag进行互相的比对，寻找个体之间单碱基差异信息[15]。综合考虑每个个体RADtag的频数表信息和比对信息，过滤掉可能来自重复区域的结果，从而得到高可信度的群体SNP标记基因分型结果[16]。其中性状关联的算法参照GLM(General Linear Model)模型[17]。, http://www.100md.com(董林林 陈中坚 王勇 魏富刚 张连娟 徐江 尉广飞 王瑞 杨娟 刘伟林 李)
[关键词]药用植物； DNA标记辅助育种； 三七； 连作障碍； 抗病品种；简化基因组测序技术； 单核苷酸多态性
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药用植物传统育种主要依赖于植物的表型选择，一个优良品种的培育往往需要花费几年甚至十几年的时间，如何提高育种效率，是育种的关键。基因型与环境间互作等多重因素会影响表型选择效率，现代分子生物技术可加快药用植物育种进程，而且缩短育种周期，其中药用植物DNA标记辅助育种以DNA多态性为基础，依据分子杂交、聚合酶链式反应、高通量测序等技术，筛选与高产、优质、抗逆等表型相联的DNA片段作为标记，辅助新品种的选育，该技术可应用于遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源遗传多样性、分子标记辅助选择等方面。随着测序成本的降低，已经陆续在中草药开展了转录组、全基因组测序，这些序列信息提供了大量的SSR和SNP等分子标记，有利于高密度遗传图谱和物理图谱的构建，高密度图谱加速了分子标记与优良性状之间的连锁研究，为发掘植物抗逆及参与有效成分合成途径的新基因提供了许多线索和启示，提高了选育的效率。陈士林等首次提出“Herbgenomics”的概念，该学科涉及中草药结构基因组、功能基因组、基因组辅助育种、中草药蛋白质组学、中草药宏基因等内容，并阐明本草基因组学将加速药用植物优良品种的选育并促进绿色中药农业的科学化和规模化发展[12]。
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本文以三七Panax notoginseng(Burk)FH Chen为例，介绍了药用植物依据DNA多态性为基础，利用高通量测序技术筛选与抗病相关联的SNP标记，辅助三七抗病新品种的选育。三七是五加科人参属植物，其性温、味甘、微苦，具有散瘀止血、消肿定痛的功能，是片仔癀、云南白药、复方三七口服液等常见中药制剂的主要原料之一[3]。三七在心脑血管方面的独特疗效越来越被人们所认可，其需求量逐年增加。为满足日益增长的需求，三七已经开展了系统的栽培技术研究，形成了较为规范的GAP技术体系[4]。然而三七为典型的生态脆弱型阴生植物，其分布区域较窄，连作障碍等问题严重[56]。三七的人工栽培过程中病虫害比较严重，例如根结线虫病害显著抑制了三七块根的生长，抑制率高达30%以上[7]；三七种植导致根际土壤微生物多样性及组成的变化，随着其种植年限增加根腐病致病菌Fusarum oxysporum的丰度显著增加[8]。在病害防治过程中，高毒农药的投入破坏了三七田间生态系统，并造成三七农残及重金属超标。而三七不同栽培品种的抗病性存在显著性差异，选育抗病性品种可获得性状优良、抗逆性强的三七群体植株，有效的减少农药的使用量[911]。抗病新品种的选育是保障三七产业可持续发展的策略之一。
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系统选育是三七遗传改良的方式之一，也是三七育种的重要手段。孫玉琴等对三七植株性状差异进行比较，结果表明三七植株的茎、块根、休眠芽、花序、叶、果实存在明显变异，为三七育种工作提供了依据[12]。通过对三七不同变异类型中皂苷含量的比较分析，确定将紫根、复叶柄平展型、长形根、宽叶4种类型作为三七品种选育的目标[13]。然而系统选育育种周期长，受环境影响较大，在短时间内选择优良性状难度极大。采用DNA标记辅助三七新品种的选育，该方法不仅准确性高，而且缩短育种周期。本研究利用高通量测序技术检测抗病群体中的SNP位点，结合PCR技术筛选与三七抗病关联的DNA片段，以此基因片段作为标记辅助系统选育，并利用该关联基因片段筛选潜在的抗病群体。该模式可加快新品种选育及推广的进程，为中药材可持续发展提供思路及策略。
1材料与方法
11三七DNA标记辅助新品种选育流程从文山周边收集抗病单株并播种于云南文山三七科技示范园的试验田，该试验田为三七连作5年病圃。采集病圃中存活三七单株的种子，建立抗病群体；采用简化基因组测序技术(restrictionsite associated dna sequencing，RADSeq) 结合PCR技术筛选抗病群体的关联SNP位点，辅助三七新品种的系统选育；通过淘汰非目标性状，分离和纯化抗病群体，选育三七抗病新品种，三七DNA标记辅助选育流程见图1。
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12SNP位点分析采用高通量测序技术筛选抗病植株特异的SNP位点，阐述其特异性。分别采集30株抗病及感根腐病三七植株，采用HiSeq PE150测序，有效数据用于分析寻找SNP标记。测序流程为：利用多种限制性内切酶对该物种DNA分别进行酶切，根据酶切实验的结果选择合适的酶进行后续实验；质检合格的DNA样品，采用RAD建库方式构建长度范围在300～500 bp的pairend文库；Illumina HiSeq PE150测序，有效数据用于分析寻找海量SNP标记。
首先，对每个样品中的RADtag进行比对归类，按照每类tag的深度信息由大到小进行排序，得到每个个体的RADtag频数表[14]。每个样品的RADtag内部进行比对得到样品内部的杂合位点信息。不同样品之间的RADtag进行互相的比对，寻找个体之间单碱基差异信息[15]。综合考虑每个个体RADtag的频数表信息和比对信息，过滤掉可能来自重复区域的结果，从而得到高可信度的群体SNP标记基因分型结果[16]。其中性状关联的算法参照GLM(General Linear Model)模型[17]。, http://www.100md.com(董林林 陈中坚 王勇 魏富刚 张连娟 徐江 尉广飞 王瑞 杨娟 刘伟林 李)