金钗石斛转录组SSR位点信息分析(1)
[摘要]SSR是应用于金钗石斛鉴定和遗传多样性研究的重要分子标记之一。为开发新的SSR标记，寻求快速鉴别金钗石斛的方法，该文通过生物信息学手段对金钗石斛转录组序列进行SSR位点搜索、分析，并设计出SSR特异性引物。结果显示，从金钗石斛转录组中搜索到32 709个SSR，分布与26 742条unigenes中，SSR位点发生频率为1290%，平均每 3 748 bp含1个SSR 位点。其中，单核苷酸是最主要重复类型，占SSR总数的7218%，其次是二核苷酸和三核苷酸，分别占SSR总数的1597%，1119%。而在所有重复基元中，A/T出现频率最高，AG/CT次之。通过设计、筛选，该研究共获得 62 157对SSR位点特异性引物。从中随机挑选20对引物进行PCR扩增，17对扩增出清晰、可重复的条带，扩增率为850%。选择3种石斛检测引物多态性，共获得多态性引物13条。以上结果表明，金钗石斛转录组测序产生的unigenes信息可作为开发SSR标记的有效来源，其中的SSR位点出现密度大、类型丰富、多态性潜能高，在金钗石斛及其近缘种的分子鉴定、遗传多样性与分子育种等方面具有较好的应用前景。
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[关键词]金钗石斛； 转录组； SSR； 位点信息
又名金钗石、扁金钗、扁黄草、扁草等，为兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium Sw多年生附生草本植物，也是历史上记载最早的石斛习用种类[1]。其新鲜或干燥茎入药具有益胃生津、滋阴清热等功效，在《神农本草经》中列为上品，并作为药用石斛最重要的基原药材被收录于历代《中国药典》。金钗石斛是传统中成药石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛清胃散以及现代中成药脉络宁注射液、复方“清咽宁”等的重要配伍成分，具有巨大的市场需求和经济价值。而现代药理学研究发现金钗石斛还具有改善记忆、抗氧化、抗肿瘤等重要功效，药用开发前景不可估量[24]。
然而，由于长期的过度开采和生境破坏，金钗石斛野生资源遭到严重的破坏，几近枯竭。日渐突出的供需矛盾，使市面上金钗石斛混淆品的泛滥现象不断加剧。据报道，市场上常有将兰科石豆兰属、金石斛属和石仙桃属等数十种植物作为药用石斛混入商品流通的现象[5]。以非适产地的劣质石斛充当优质金钗石斛的现象屡见不鲜。而对于大部分人工栽培的金钗石斛，其确切的种源地无法考证、遗传背景认识不清等问题更是久存不解。如此种种，严重影响了金钗石斛的药效质量和开发利用，寻找高效、便捷的鉴别方法迫在眉睫。
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近年来，随着分子生物技术的發展，分子标记逐步应用于金钗石斛药材鉴别和种质资源研究中，其中SSR(simple sequence repeats，简单重复序列)标记凭借其多态性高、可重复性强、共显性等优点，成为金钗石斛重要的分子标记之一[6]。然而，由于传统的SSR标记开发过程繁琐、工作量大，费用高，现阶段针对金钗石斛的SSR系统研究还比较少，已开发的金钗石斛SSR 标记也仅198对，难以满足研究的需求。所幸的是，随着新一代测序技术的发展，从转录组数据中大规模开发SSR标记成为可能。目前，该技术已成功应用于地黄[7]、荚膜黄芪[8]等药用植物的SSR标记开发过程中。基于此，本文将首次对金钗石斛转录组数据中的SSR位点进行检测，分析其分布、组成特征，并初步评价其可用性，设计SSR引物，旨在丰富金钗石斛的分子标记库，为金钗石斛的分子鉴定、遗传多样性研究及分子育种提供有效的工具。
1材料与方法
11金钗石斛转录组数据来源本实验转录组测序样本来源于贵州赤水的金钗石斛组培苗，提取茎RNA后送北京诺禾致源生物信息科技有限公司，利用Illumina HiSeq 4000高通量测序平台对其进行转录组测序，最终获得207 283条unigenes。
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12金钗石斛转录组SSR的筛选使用MISA (http：//pgrc ipkgatersleben de/misa/Misa html) 对金钗石斛转录组中的SSR位点进行搜索和定位。搜索的标准为单核苷酸重复至少10次，二核苷酸至少重复6次，三至六核苷酸至少重复5次；同时筛选被间隔小于或等于100 bp碱基打断的复合型 SSR。
13金钗石斛SSR引物设计调用 Primer 30引物批量设计程序对含有 SSR位点的两端序列设计引物，每条SSR序列产生3条引物。主要的引物参数设置为：退火温度(Tm)在57～63 ℃，上、下游引物的Tm相差不大于5 ℃；扩增产物大小在100～280 bp；引物长度 在18～27 bp；GC量在40%～65%。将设计出的引物通过以下方式筛选：引物不能存在SSR；将获得的引物比对到unigene序列，引物的5′端允许有3个碱基的错配，3′端允许有1个碱基的错配；去掉比对到不同unigenes上的引物，筛选唯一匹配的引物；使用SSRFinder校验SSR，使用产物序列来寻找SSR，检验结果是否与MISA 结果相同，并筛选出相同的SSR产物。
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14金钗石斛SSR引物PCR扩增随机选择合成20对引物(苏州金唯智生物科技有限公司)，并提取金钗石斛、铁皮石斛、霍山石斛叶片DNA(北京艾德莱生物科技有限公司，CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒)。PCR扩增反应在Eppendof Mastercycle 梯度PCR仪上进行。
25 μL的PCR反应扩增体系：Taq PCR Master Mix (2×)125 μL，10 μmol·L-1上下引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR扩增程序为94 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性1 min，最佳Tm退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸5 min。扩增产物用3%琼脂糖凝胶电泳检测。
2结果与分析
21金钗石斛SSR数量与分布对金钗石斛转录组测序获得的207 283条unigenes进行检索，共在26 742条unigenes中找到符合条件的32 709个SSR。SSR发生频率(含有SSR的unigenes数目与总unigenes数目之比)为1290%，出现频率(检出SSR个数与总unigenes数目之比)为1578%。其中28 061条unigenes含单个SSR 位点，4 648条unigenes含2个及2个以上SSR 位点。复合型SSR数目为1 572个。, http://www.100md.com(李清 李标 郭顺星)
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[关键词]金钗石斛； 转录组； SSR； 位点信息
又名金钗石、扁金钗、扁黄草、扁草等，为兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium Sw多年生附生草本植物，也是历史上记载最早的石斛习用种类[1]。其新鲜或干燥茎入药具有益胃生津、滋阴清热等功效，在《神农本草经》中列为上品，并作为药用石斛最重要的基原药材被收录于历代《中国药典》。金钗石斛是传统中成药石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛清胃散以及现代中成药脉络宁注射液、复方“清咽宁”等的重要配伍成分，具有巨大的市场需求和经济价值。而现代药理学研究发现金钗石斛还具有改善记忆、抗氧化、抗肿瘤等重要功效，药用开发前景不可估量[24]。
然而，由于长期的过度开采和生境破坏，金钗石斛野生资源遭到严重的破坏，几近枯竭。日渐突出的供需矛盾，使市面上金钗石斛混淆品的泛滥现象不断加剧。据报道，市场上常有将兰科石豆兰属、金石斛属和石仙桃属等数十种植物作为药用石斛混入商品流通的现象[5]。以非适产地的劣质石斛充当优质金钗石斛的现象屡见不鲜。而对于大部分人工栽培的金钗石斛，其确切的种源地无法考证、遗传背景认识不清等问题更是久存不解。如此种种，严重影响了金钗石斛的药效质量和开发利用，寻找高效、便捷的鉴别方法迫在眉睫。
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近年来，随着分子生物技术的發展，分子标记逐步应用于金钗石斛药材鉴别和种质资源研究中，其中SSR(simple sequence repeats，简单重复序列)标记凭借其多态性高、可重复性强、共显性等优点，成为金钗石斛重要的分子标记之一[6]。然而，由于传统的SSR标记开发过程繁琐、工作量大，费用高，现阶段针对金钗石斛的SSR系统研究还比较少，已开发的金钗石斛SSR 标记也仅198对，难以满足研究的需求。所幸的是，随着新一代测序技术的发展，从转录组数据中大规模开发SSR标记成为可能。目前，该技术已成功应用于地黄[7]、荚膜黄芪[8]等药用植物的SSR标记开发过程中。基于此，本文将首次对金钗石斛转录组数据中的SSR位点进行检测，分析其分布、组成特征，并初步评价其可用性，设计SSR引物，旨在丰富金钗石斛的分子标记库，为金钗石斛的分子鉴定、遗传多样性研究及分子育种提供有效的工具。
1材料与方法
11金钗石斛转录组数据来源本实验转录组测序样本来源于贵州赤水的金钗石斛组培苗，提取茎RNA后送北京诺禾致源生物信息科技有限公司，利用Illumina HiSeq 4000高通量测序平台对其进行转录组测序，最终获得207 283条unigenes。
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12金钗石斛转录组SSR的筛选使用MISA (http：//pgrc ipkgatersleben de/misa/Misa html) 对金钗石斛转录组中的SSR位点进行搜索和定位。搜索的标准为单核苷酸重复至少10次，二核苷酸至少重复6次，三至六核苷酸至少重复5次；同时筛选被间隔小于或等于100 bp碱基打断的复合型 SSR。
13金钗石斛SSR引物设计调用 Primer 30引物批量设计程序对含有 SSR位点的两端序列设计引物，每条SSR序列产生3条引物。主要的引物参数设置为：退火温度(Tm)在57～63 ℃，上、下游引物的Tm相差不大于5 ℃；扩增产物大小在100～280 bp；引物长度 在18～27 bp；GC量在40%～65%。将设计出的引物通过以下方式筛选：引物不能存在SSR；将获得的引物比对到unigene序列，引物的5′端允许有3个碱基的错配，3′端允许有1个碱基的错配；去掉比对到不同unigenes上的引物，筛选唯一匹配的引物；使用SSRFinder校验SSR，使用产物序列来寻找SSR，检验结果是否与MISA 结果相同，并筛选出相同的SSR产物。
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14金钗石斛SSR引物PCR扩增随机选择合成20对引物(苏州金唯智生物科技有限公司)，并提取金钗石斛、铁皮石斛、霍山石斛叶片DNA(北京艾德莱生物科技有限公司，CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒)。PCR扩增反应在Eppendof Mastercycle 梯度PCR仪上进行。
25 μL的PCR反应扩增体系：Taq PCR Master Mix (2×)125 μL，10 μmol·L-1上下引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR扩增程序为94 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性1 min，最佳Tm退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸5 min。扩增产物用3%琼脂糖凝胶电泳检测。
2结果与分析
21金钗石斛SSR数量与分布对金钗石斛转录组测序获得的207 283条unigenes进行检索，共在26 742条unigenes中找到符合条件的32 709个SSR。SSR发生频率(含有SSR的unigenes数目与总unigenes数目之比)为1290%，出现频率(检出SSR个数与总unigenes数目之比)为1578%。其中28 061条unigenes含单个SSR 位点，4 648条unigenes含2个及2个以上SSR 位点。复合型SSR数目为1 572个。, http://www.100md.com(李清 李标 郭顺星)