茉莉酸甲酯对明党参植株和悬浮细胞中呋喃香豆素积累的影响(1)
[摘要]佛手酚、佛手柑内酯和花椒毒素为明党参中天然呋喃香豆素成分，具多重药理作用。以明党参栽培品和悬浮培养细胞为材料，研究茉莉酸甲酯处理后呋喃香豆素积累状况和一系列生理生化指标变化。结果显示，茉莉酸甲酯不同程度地促进明党参中各呋喃香豆素合成，柄悬浮细胞中产量高于叶悬浮细胞。于培养周期第10天加入100 μmol·L-1茉莉酸甲酯对明党参悬浮细胞作用效果最明显，最适收获时间为处理4 d后，此时柄悬浮细胞中佛手酚，花椒毒素和佛手柑内酯产量分别是未诱导细胞的736，19，427倍。茉莉酸甲酯诱导呋喃香豆素增长的同时抑制细胞活力和生物量积累，激发细胞防御反应。该研究初次系统地探索了茉莉酸甲酯对明党参中呋喃香豆素的诱导效果，并为大量生产3种活性成分和探明茉莉酸甲酯诱导机制奠定基础。
[关键词]明党参； 呋喃香豆素； 茉莉酸甲酯； 诱导
明党参Changium smyrnioides Wollf为我国特有的伞形科植物，收录于《中国植物红皮书》，属易危级[12]。其根作为药材明党参载于现版药典，具润肺化痰，养阴和胃，解毒之功效[3]，亦作为重要药材行销东南亚各地。明党参活性成分的前期研究着重于多糖、脂肪酸和挥发油等方面，呋喃香豆素是近年来研究较多的特征性成分[4]，广泛存在于明党参全株及组织培养材料中[57]，是明党参滋补強壮功效的物质基础之一，现代药理研究认为其具有抗氧化、抗肿瘤、抗HIV、抗惊厥等多重药理活性[811]，极具开发利用价值。
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组织培养技术可用于生产药用植物有效成分，结合诱导子可获取大量目标产物，明党参在此方面的研究较少且前期仅以多糖为指标，鲜有以呋喃香豆素为目标的培养研究[1215]。茉莉酸甲酯(MeJA)作为植物信号分子和常用的化学诱导子[1617]，对多种植物器官或组织培养材料中香豆素类成分表现出明显的诱导作用[1821]。本实验首次系统地探索MeJA对明党参原植株和悬浮细胞生长的影响和其中3种呋喃香豆素的诱导效果，以期获得最高产量，为进一步用于扩大化生产这3种天然产物奠定基础，也为呋喃香豆素资源的开发和珍稀药用植物明党参的可持续利用提供新途径。另一方面，本实验探讨了诱导过程中一系列植物生理生化指标的变化，为研究MeJA对明党参的诱导机制提供依据。
1材料
11样品植物材料栽培于南京中医药大学仙林校区药苑，经南京中医药大学中药资源教研室陈建伟教授鉴定为伞形科明党参Ch smyrnioides。取幼嫩叶与叶柄诱导愈伤组织，采用MS培养基，激素配比分别为NAA 15 mg·L-1+2，4D 05 mg·L-1+KT 02 mg·L-1+6BA 05 mg·L-1和NAA 15 mg·L-1+2，4D 15 mg·L-1+KT 02 mg·L-1+6BA 05 mg·L1[12，22]。初代愈伤组织继代3次后，用镊子捏碎接种于对应的pH为58，含蔗糖30 g·L-1的MS液体培养基中，于25 ℃，光照强度1 500 lx，转速120 r·min-1的摇床中培养。选取生长力强且含呋喃香豆素较多的叶和叶柄初代悬浮细胞系经50目镍网滤过，作为细胞母液继代备用，继代起始浓度为干重20 mg·L-1。
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12仪器与试剂DHZDA冷冻恒温振荡器(太仓实验设备厂)；SPX300BG光照培养箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)；FD1A50真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司，Waters 2998 PDA检测器)；KH500DB数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。对照品花椒毒素(批号JN01KEJR，东京化成工业株式会社)；对照品佛手柑内酯和佛手酚为本实验室自明党参根皮分离而得，经HPLC归一化测定，纯度均大于98%。色谱级甲醇(江苏汉邦科技有限公司)，其余试剂为分析纯。
2方法
21MeJA对明党参植株呋喃香豆素积累的影响于4月上旬明党参生长旺盛时期向其地上部分均匀喷施200 μmol·L-1MeJA，对照组喷以蒸馏水，处理后第0，1，2，3，4，5天采收并分拣叶与叶柄，测定呋喃香豆素含量。
22MeJA浓度对明党参悬浮细胞呋喃香豆素积累的影响取同批继代的悬浮细胞，在生长周期第8天向培养体系中分别加入0，50，100，200 μmol·L-1MeJA，继续培养5 d后收获样品，测定细胞生物量、活力和3种呋喃香豆素含量。
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23MeJA加入时间点对明党参悬浮细胞呋喃香豆素积累的影响取同批继代的悬浮细胞，分别在生长周期第0，5，8，10，12 天加入100 μmol·L-1MeJA，继续培养至第15 天收获样品，测定细胞生物量、活力和3种呋喃香豆素含量。
24MeJA处理后明党参悬浮细胞呋喃香豆素动态积累取同批继代的悬浮细胞，在生长周期第10天加入100 μmol·L-1MeJA，处理后第0 天起每天收获样品直至第5天，测定细胞生物量、活力、3种呋喃香豆素含量和相关生理生化指标。
25细胞生物量及活力测定量得悬浮细胞培养物总体积，抽滤后称重，其与培养物总体积比值为细胞鲜重，细胞经冷冻干燥后再次称量，其与培养物总体积比值为干重。采用TTC法测定活力[2324]，精密称取02 g新鲜收获的细胞于离心管中，加04% TTC溶液和01 mol·L-1 pH 70 PBS溶液各25 mL，混匀，25 ℃避光反应20 h。离心，弃上清，加5 mL无水乙醇，混匀，于60 ℃水浴并振荡30 min，冷却，离心，取上清，测定485 nm处吸光度，其与样品质量比值即为细胞活力值。
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26呋喃香豆素含量测定分别测定细胞与培养液中呋喃香豆素含量，两者之和为悬浮细胞体系中总量。取明党参细胞冻干粉末(过4号筛)05 g，精密称定，加甲醇50 mL，于60 kHz超声提取60 min，过滤，滤液挥发溶剂，用甲醇定容至5 mL，过045 μm滤膜，即得细胞供试品溶液。量得滤后培养液总体积，取50 mL，于40 ℃减压干燥，加甲醇溶解，收集滤液，挥发溶剂，用甲醇定容到2 mL，过045 μm滤膜，即得培养液供试品溶液。采用高效液相色谱法测定3种香豆素含量，参照周萍等[13]方法，AgilentC18色谱柱(46 mm×250 mm，5 μm)，柱温30 ℃，检测波长为314 nm，进样量为10 μL，流速为10 mL·min-1，水(A)甲醇(B)梯度洗脱程序为0～5 min，80%～70% A；5～25 min，70%～60% A；25～35 min，60%～40% A；35～50 min，40%～30% A；50～60 min，30%～0% A；60～70 min，0%～80% A。原植物叶、叶柄处理和测定方法与明党参细胞相同。, http://www.100md.com(蔡静 马赟 陈建伟 李祥 周萍)
[关键词]明党参； 呋喃香豆素； 茉莉酸甲酯； 诱导
明党参Changium smyrnioides Wollf为我国特有的伞形科植物，收录于《中国植物红皮书》，属易危级[12]。其根作为药材明党参载于现版药典，具润肺化痰，养阴和胃，解毒之功效[3]，亦作为重要药材行销东南亚各地。明党参活性成分的前期研究着重于多糖、脂肪酸和挥发油等方面，呋喃香豆素是近年来研究较多的特征性成分[4]，广泛存在于明党参全株及组织培养材料中[57]，是明党参滋补強壮功效的物质基础之一，现代药理研究认为其具有抗氧化、抗肿瘤、抗HIV、抗惊厥等多重药理活性[811]，极具开发利用价值。
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1材料
11样品植物材料栽培于南京中医药大学仙林校区药苑，经南京中医药大学中药资源教研室陈建伟教授鉴定为伞形科明党参Ch smyrnioides。取幼嫩叶与叶柄诱导愈伤组织，采用MS培养基，激素配比分别为NAA 15 mg·L-1+2，4D 05 mg·L-1+KT 02 mg·L-1+6BA 05 mg·L-1和NAA 15 mg·L-1+2，4D 15 mg·L-1+KT 02 mg·L-1+6BA 05 mg·L1[12，22]。初代愈伤组织继代3次后，用镊子捏碎接种于对应的pH为58，含蔗糖30 g·L-1的MS液体培养基中，于25 ℃，光照强度1 500 lx，转速120 r·min-1的摇床中培养。选取生长力强且含呋喃香豆素较多的叶和叶柄初代悬浮细胞系经50目镍网滤过，作为细胞母液继代备用，继代起始浓度为干重20 mg·L-1。
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12仪器与试剂DHZDA冷冻恒温振荡器(太仓实验设备厂)；SPX300BG光照培养箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)；FD1A50真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司，Waters 2998 PDA检测器)；KH500DB数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。对照品花椒毒素(批号JN01KEJR，东京化成工业株式会社)；对照品佛手柑内酯和佛手酚为本实验室自明党参根皮分离而得，经HPLC归一化测定，纯度均大于98%。色谱级甲醇(江苏汉邦科技有限公司)，其余试剂为分析纯。
2方法
21MeJA对明党参植株呋喃香豆素积累的影响于4月上旬明党参生长旺盛时期向其地上部分均匀喷施200 μmol·L-1MeJA，对照组喷以蒸馏水，处理后第0，1，2，3，4，5天采收并分拣叶与叶柄，测定呋喃香豆素含量。
22MeJA浓度对明党参悬浮细胞呋喃香豆素积累的影响取同批继代的悬浮细胞，在生长周期第8天向培养体系中分别加入0，50，100，200 μmol·L-1MeJA，继续培养5 d后收获样品，测定细胞生物量、活力和3种呋喃香豆素含量。
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23MeJA加入时间点对明党参悬浮细胞呋喃香豆素积累的影响取同批继代的悬浮细胞，分别在生长周期第0，5，8，10，12 天加入100 μmol·L-1MeJA，继续培养至第15 天收获样品，测定细胞生物量、活力和3种呋喃香豆素含量。
24MeJA处理后明党参悬浮细胞呋喃香豆素动态积累取同批继代的悬浮细胞，在生长周期第10天加入100 μmol·L-1MeJA，处理后第0 天起每天收获样品直至第5天，测定细胞生物量、活力、3种呋喃香豆素含量和相关生理生化指标。
25细胞生物量及活力测定量得悬浮细胞培养物总体积，抽滤后称重，其与培养物总体积比值为细胞鲜重，细胞经冷冻干燥后再次称量，其与培养物总体积比值为干重。采用TTC法测定活力[2324]，精密称取02 g新鲜收获的细胞于离心管中，加04% TTC溶液和01 mol·L-1 pH 70 PBS溶液各25 mL，混匀，25 ℃避光反应20 h。离心，弃上清，加5 mL无水乙醇，混匀，于60 ℃水浴并振荡30 min，冷却，离心，取上清，测定485 nm处吸光度，其与样品质量比值即为细胞活力值。
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26呋喃香豆素含量测定分别测定细胞与培养液中呋喃香豆素含量，两者之和为悬浮细胞体系中总量。取明党参细胞冻干粉末(过4号筛)05 g，精密称定，加甲醇50 mL，于60 kHz超声提取60 min，过滤，滤液挥发溶剂，用甲醇定容至5 mL，过045 μm滤膜，即得细胞供试品溶液。量得滤后培养液总体积，取50 mL，于40 ℃减压干燥，加甲醇溶解，收集滤液，挥发溶剂，用甲醇定容到2 mL，过045 μm滤膜，即得培养液供试品溶液。采用高效液相色谱法测定3种香豆素含量，参照周萍等[13]方法，AgilentC18色谱柱(46 mm×250 mm，5 μm)，柱温30 ℃，检测波长为314 nm，进样量为10 μL，流速为10 mL·min-1，水(A)甲醇(B)梯度洗脱程序为0～5 min，80%～70% A；5～25 min，70%～60% A；25～35 min，60%～40% A；35～50 min，40%～30% A；50～60 min，30%～0% A；60～70 min，0%～80% A。原植物叶、叶柄处理和测定方法与明党参细胞相同。, http://www.100md.com(蔡静 马赟 陈建伟 李祥 周萍)