红花黄酮类成分累积量与功能基因表达水平的关联分析(1)
[摘要]记录并计算红花开花1～7 d的平均产量，采用HPLC检测红花中羟基红花黄色素A(HYSA)、槲皮素、柚皮素和山柰酚的含量，使用Realtime PCR检测chs，chi的相对表达量，并进行相关性分析。红花平均产量、HYSA和柚皮素的含量及基因表达量之间呈现相似的变化趋势。平均产量于开花第3天达到最大值，与HYSA含量存在较高正相关性(r=0756，P<005)，与chi的相对表达量存在极高正相关性(r=0892，P<001)；柚皮素含量与chs的相对表达量存在较高正相关性(r=0766，P<005)。该研究为红花中黄酮类成分合成及调控机制研究提供理论依据，为研究红花品质差异形成的分子机制奠定基础。
[关键词]红花； 黄酮类成分； 平均产量； 功能基因； chs； chi
红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L的干燥花，夏季花由黄变红时采摘，阴干或晒干[1]，是临床常用的活血化瘀要药。据统计，《中国药典》2015年版收载含红花的中成药达近百种。目前红花主产于新疆准噶尔盆地边缘、伊犁河谷地带，年产量达27×104～36×104 t，占全国红花种植面积和总产量的80%左右。
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羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)、槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)和山柰酚(kaempferol)均为红花中的黄酮类成分，是活血化瘀的主要有效成分。黄酮类成分合成途径可分为2个阶段：第一阶段通过莽草酸途径和乙酸丙二酸途径合成黄酮类基本骨架前体物质——4香豆酰辅酶A(4coumaroylCoA)及丙二酰辅酶A(malonylCoA)。第二阶段是黄酮类代谢的关键步骤，即1分子4香豆酰辅酶A及3分子丙二酰辅酶A在各类酶的作用下形成醌式查尔酮类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类及黄酮醇类等化合物。查尔酮合成酶(chalconesynthase，CHS)是红花黄酮类成分生物合成途径的第一个关键酶，可形成具有C13架的黄酮类化合物——查尔酮，可作为中间产物进一步转化构成醌式查尔酮类和柚皮素[2]。查尔酮异构酶(chalconeflavononeisomerase，CHI)是红花黄酮类成分生物合成途径分支上的第一个关键酶[3]，可催化分子内的环化反应，使查尔酮类结构异构形成柚皮素，继而在各类酶的作用下形成二氢黄酮类、二氢黄酮醇类及黄酮醇类等化合物[4]。chs与chi分别在灯盏花、桑、决明等的研究中证明为黄酮类成分合成途径中的关键酶基因。
, 百拇医药
因此，本研究对开花1～7 d的红花进行平均产量、黄酮类成分动态累积量及功能基因相对表达量的检测，并进行关联性分析，为红花中黄酮类成分合成及调控机制研究提供理论依据，同时也为研究红花品质差异形成的分子机制奠定基础。
1材料
红花种子来源于四川省农业科学院——简阳市石盘镇中药材资源基地，种植于成都中医药大学药用植物园内，经成都中医药大学裴瑾教授鉴定为菊科植物红花C inctorius于2015年1月24日播种，2015年5月31日开花。于开花1～7 d每日上午8：00采摘，清洁并吸干水分后置冻存管内，立即放入液氮中速冻，带回实验室，一部分直接提取RNA，质量合格者反转录成cDNA，置-20 ℃冰箱中备用；一部分低温冷冻干燥24 h，IKA液氮打粉机粉碎，用于含量测定。
色谱纯乙腈、甲醇(美国Fisher公司)；分析纯磷酸(成都市科龙化工试剂厂)；超纯水(自制)；羟基红花黄色素A对照品(批号 MUST15072815，成都曼斯特生物科技有限公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(包括化学工作站)、Agilent 1260 DAD紫外检测器(美国 Agilent Technologies公司)；电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；2×Taq PCR Master Mix、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂(天根生化科技有限公司)；荧光定量PCR仪(美国BioRad公司)。
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2方法
21红花平均产量计算
采摘开花1～7 d整个花序的管状花，随机取50朵长度15 cm左右的管状花，清洁并吸干水分后称重(M)；随机标记10个花序，于开花1～7 d每日对开放管状花进行计数，计算平均值(N)。计算红花平均产量(开花1～7 d每个花序管状花的平均质量)=M·N/50。
22HPLC测定黄酮类成分含量
221HYSA含量测定[5] 精密称取红花粉末04 g，精密量取25%甲醇50 mL，称量，25 ℃超声(300 W，50 kHz)处理40 min，取出后称重并补足失重。用045 μm滤膜过滤得供试品溶液。Agilent Zorbax Eclipse XDBC18色谱柱(46 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇乙腈07%磷酸溶液(26∶2∶72)为流动相，等度洗脱；检测波长 403 nm；流速 08 mL·min-1；柱温 25 ℃；进样量 10 μL。
, 百拇医药
222槲皮素、柚皮素和山柰酚含量测定精密称取红花粉末10 g，精密量取甲醇25 mL，95 ℃回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液15 mL，置平底烧瓶中，加盐酸溶液(取15～37 mL)5 mL，摇匀，置水浴中加热水解30 min，立即冷却，转移至25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。Agilent Zorbax Eclipse XDBC18色谱柱(46 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇04%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱；检测波长 360，254 nm；流速 10 mL·min-1；柱溫 25 ℃；进样量 20 μL。
23chs基因表达分析[6] 查阅文献[3]，得到红花chs(上游引物5′GTCGTCCTCTTCGTTGTGGT3′；下游引物5′CAAAGGCGAAAAGACGATTC3′)和内参基因25s(上游引物5′GGAGGTTGAGGGAAAAGGAG3′，下游引物5′GTGACCTCGTCACCCGTAGT3′)的Realtime PCR引物序列。扩增体系10 μL：Thunderbird SYBR qPCR Mix，5 μL；上游引物 05 μL；下游引物 05 μL；cDNA模板，1 μL；ddH2O，3 μL。考察引物扩增曲线、溶解曲线及标准曲线，考察Realtime PCR条件(退火温度以50～65 ℃梯度考察)：94 ℃，3 min；30个循环(94 ℃ 30 s，50～65 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min)；72 ℃ 5 min。确定条件并测定红花chs和内参基因25s的表达量。, 百拇医药(吴沂芸 陈翠平 任超翔 吴清华 陈江 裴瑾)
[关键词]红花； 黄酮类成分； 平均产量； 功能基因； chs； chi
红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L的干燥花，夏季花由黄变红时采摘，阴干或晒干[1]，是临床常用的活血化瘀要药。据统计，《中国药典》2015年版收载含红花的中成药达近百种。目前红花主产于新疆准噶尔盆地边缘、伊犁河谷地带，年产量达27×104～36×104 t，占全国红花种植面积和总产量的80%左右。
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羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)、槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)和山柰酚(kaempferol)均为红花中的黄酮类成分，是活血化瘀的主要有效成分。黄酮类成分合成途径可分为2个阶段：第一阶段通过莽草酸途径和乙酸丙二酸途径合成黄酮类基本骨架前体物质——4香豆酰辅酶A(4coumaroylCoA)及丙二酰辅酶A(malonylCoA)。第二阶段是黄酮类代谢的关键步骤，即1分子4香豆酰辅酶A及3分子丙二酰辅酶A在各类酶的作用下形成醌式查尔酮类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类及黄酮醇类等化合物。查尔酮合成酶(chalconesynthase，CHS)是红花黄酮类成分生物合成途径的第一个关键酶，可形成具有C13架的黄酮类化合物——查尔酮，可作为中间产物进一步转化构成醌式查尔酮类和柚皮素[2]。查尔酮异构酶(chalconeflavononeisomerase，CHI)是红花黄酮类成分生物合成途径分支上的第一个关键酶[3]，可催化分子内的环化反应，使查尔酮类结构异构形成柚皮素，继而在各类酶的作用下形成二氢黄酮类、二氢黄酮醇类及黄酮醇类等化合物[4]。chs与chi分别在灯盏花、桑、决明等的研究中证明为黄酮类成分合成途径中的关键酶基因。
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因此，本研究对开花1～7 d的红花进行平均产量、黄酮类成分动态累积量及功能基因相对表达量的检测，并进行关联性分析，为红花中黄酮类成分合成及调控机制研究提供理论依据，同时也为研究红花品质差异形成的分子机制奠定基础。
1材料
红花种子来源于四川省农业科学院——简阳市石盘镇中药材资源基地，种植于成都中医药大学药用植物园内，经成都中医药大学裴瑾教授鉴定为菊科植物红花C inctorius于2015年1月24日播种，2015年5月31日开花。于开花1～7 d每日上午8：00采摘，清洁并吸干水分后置冻存管内，立即放入液氮中速冻，带回实验室，一部分直接提取RNA，质量合格者反转录成cDNA，置-20 ℃冰箱中备用；一部分低温冷冻干燥24 h，IKA液氮打粉机粉碎，用于含量测定。
色谱纯乙腈、甲醇(美国Fisher公司)；分析纯磷酸(成都市科龙化工试剂厂)；超纯水(自制)；羟基红花黄色素A对照品(批号 MUST15072815，成都曼斯特生物科技有限公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(包括化学工作站)、Agilent 1260 DAD紫外检测器(美国 Agilent Technologies公司)；电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；2×Taq PCR Master Mix、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂(天根生化科技有限公司)；荧光定量PCR仪(美国BioRad公司)。
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2方法
21红花平均产量计算
采摘开花1～7 d整个花序的管状花，随机取50朵长度15 cm左右的管状花，清洁并吸干水分后称重(M)；随机标记10个花序，于开花1～7 d每日对开放管状花进行计数，计算平均值(N)。计算红花平均产量(开花1～7 d每个花序管状花的平均质量)=M·N/50。
22HPLC测定黄酮类成分含量
221HYSA含量测定[5] 精密称取红花粉末04 g，精密量取25%甲醇50 mL，称量，25 ℃超声(300 W，50 kHz)处理40 min，取出后称重并补足失重。用045 μm滤膜过滤得供试品溶液。Agilent Zorbax Eclipse XDBC18色谱柱(46 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇乙腈07%磷酸溶液(26∶2∶72)为流动相，等度洗脱；检测波长 403 nm；流速 08 mL·min-1；柱温 25 ℃；进样量 10 μL。
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222槲皮素、柚皮素和山柰酚含量测定精密称取红花粉末10 g，精密量取甲醇25 mL，95 ℃回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液15 mL，置平底烧瓶中，加盐酸溶液(取15～37 mL)5 mL，摇匀，置水浴中加热水解30 min，立即冷却，转移至25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。Agilent Zorbax Eclipse XDBC18色谱柱(46 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇04%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱；检测波长 360，254 nm；流速 10 mL·min-1；柱溫 25 ℃；进样量 20 μL。
23chs基因表达分析[6] 查阅文献[3]，得到红花chs(上游引物5′GTCGTCCTCTTCGTTGTGGT3′；下游引物5′CAAAGGCGAAAAGACGATTC3′)和内参基因25s(上游引物5′GGAGGTTGAGGGAAAAGGAG3′，下游引物5′GTGACCTCGTCACCCGTAGT3′)的Realtime PCR引物序列。扩增体系10 μL：Thunderbird SYBR qPCR Mix，5 μL；上游引物 05 μL；下游引物 05 μL；cDNA模板，1 μL；ddH2O，3 μL。考察引物扩增曲线、溶解曲线及标准曲线，考察Realtime PCR条件(退火温度以50～65 ℃梯度考察)：94 ℃，3 min；30个循环(94 ℃ 30 s，50～65 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min)；72 ℃ 5 min。确定条件并测定红花chs和内参基因25s的表达量。, 百拇医药(吴沂芸 陈翠平 任超翔 吴清华 陈江 裴瑾)