醋制对商陆及商陆正丁醇部位中皂苷类成分含量的影响(1)
[摘要]为研究醋制对商陆及商陆正丁醇部位皂苷类成分的影响，比较商陆中主要毒性成分商陆皂苷B(EsB)和商陆皂苷C(EsC)醋制前后含量的变化，依据商陆《中国药典》醋炙工艺，将商陆正丁醇部位进行模拟醋制；采用液质联用法对商陆正丁醇部位醋制前后皂苷类成分进行研究；采用HPLCELSD方法检测毒性成分EsC和EsB在商陆生品、醋制品中的含量，考察商陆醋制前后的含量变化。结果显示，商陆正丁醇部位中除商陆皂苷甲(EsA)以外，各商陆皂苷类成分含量均不同程度下降，皂苷类化合物组成显著变化，但醋制后未见新化合物生成；含量测定发现生商陆中EsC和EsB的质量分数分别为012%，020%，醋制后下降为048%，0094%。表明醋制能够显著改变商陆及商陆正丁醇部位中皂苷类成分的组成，显著降低毒性皂苷EsC和EsB的含量，表明商陆采用醋制法炮制的科学性。
[关键词]商陆； 商陆皂苷； 液质联用； HPLC； EsC； EsB；
商陆科有毒中药商陆Phytolacca acinosa Roxb或垂序商陆P americama L有逐水消肿的功能，主治水肿胀满、二便不通，临床应用广泛。但自《神农本草经》以来历代本草医书均记载为有毒，故临床使用其炮制品，以降低毒性缓和药性[1]。临床误服鲜品或生品，毒性表现中最为常见的腹痛、腹泻[24]，是商陆的主要毒副作用，但其毒性作用机制未明，而醋制后毒性明显下降[5]。课题组前期研究发现商陆正丁醇萃取部位具有强烈的刺激性，并能引起炎症和导致肠道腹泻，是商陆的主要毒性部位，其他部位未见明显毒性[67]。进一步研究表明正丁醇部位中多种皂苷类成分如商陆皂苷B、商陆皂苷C具有显著的致炎毒性[6]，能引起肠道水通道蛋白表达变化[8]。且可能与其引起肠道腹泻相关[911]。商陆有毒，历版《中国药典》亦以醋炙法炮制商陆，以缓和峻下逐水的作用。故本实验采用液质联用及HPLC研究醋制对商陆正丁醇部位皂苷类成分及主要毒性成分EsB和EsC醋制前后含量的影响，以期阐释商陆醋制解毒机制。
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1材料
液质联用：20DXR HPL系统(SHIMADZU公司，日本)；Triple TOFTM5600质谱仪(美国AB SCIEX公司)配有电喷雾离子源(ESI)。
Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Alltech 2000ES ELSD检测器；Purospher C18色谱柱(46 mm×250 mm，5 μm)；Labconco(6 L)冷冻干燥机(美国Labconco公司)SpringS15i超纯水发生器；KQ500DE型医用数控超声清洗器；Rotavapor R210旋转蒸发仪(BUCHI)；HH2K4二列四孔智能水浴锅(南京科尔仪器设备有限公司)；BP211D电子天平(德国Sartorius公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；美的电磁炉。
镇江香醋(江苏恒顺醋业股份有限公司，总酸550～599 g·L-1，批号20150723/A3)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司，批号20140122)；色谱甲醇(Scharlau公司，批号67561)。其余试剂均为分析纯。水为超纯水。
, 百拇医药
生商陆饮片购自精华制藥亳州康普有限公司(云南产，批号131201)。饮片经江苏省食品药品检验所胡皓彬主任药师鉴定为商陆科植物垂序商陆P americana的干燥根。
2方法与结果
21样品制备
商陆正丁醇部位浸膏的制备：将生商陆10 kg，置于中药提取罐中，加入8倍量70%乙醇回流提取2 h，取出提取液，残渣加入6倍量70%乙醇回流提取1 h，重复上述操作，合并3次提取液，旋转蒸发仪减压浓缩，得醇浸膏。将商陆70%乙醇浸膏用适量水溶解，分别先以石油醚、二氯甲烷萃取，母液再加入4倍量水饱和正丁醇，萃取数次，合并萃取液，回收溶剂，冻干，得正丁醇浸膏。
醋制正丁醇部位浸膏的制备：取正丁醇浸膏100 g，根据商陆饮片炮制加醋量(每100 kg生商陆加醋30 kg)和正丁醇部位浸膏的得率(20%)，故加150 g食醋，100 ℃煮30 min，减压浓缩，冷冻干燥后得到醋制后正丁醇部位。
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醋商陆饮片自制，按照2015年版《中国药典》中醋炙法制得，即取净商陆100 g，加入30 g醋拌匀，闷润至醋被吸尽，文火炒干，晾凉。
商陆皂苷(esculentoside，Es)A，B，C，D，F均为实验室自制。
22醋制对商陆正丁醇部位中皂苷类成分含量的影响
221供试品溶液的制备取商陆正丁醇部位浸膏、醋制正丁醇部位浸膏适量，加甲醇制成1 g·L-1。
222色谱条件及质谱条件Purospher C18色谱柱；流动相甲醇(A)01%甲酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～5 min，35%～45%A；5～15 min，45%～60%A；15～25 min，60%A；25～30 min，60%～65%A；30～40 min，65%～80%A；40～55 min，80%A；55～56 min，80%～35%A；56～60 min，35%A)；流速为1 mL·min-1；柱温30 ℃。
采用电喷雾负离子模式检测，一级质谱参数：离子源气155 V；离子源气255 V；气帘气 40 V；离子源温度 550 ℃；TSVF -4 500V；除簇电压-60 V；碰撞能量-35 V；碰撞能量补偿 15 V。质谱扫描范围m/z 100～1 200。氮气为保护气和喷雾气。
223数据采集分析使用PeakviewTM软件进行数据采集和分析，得到精确的质量、母离子和碎片离子。通过比较目标对照品相对分子质量和保留时间对色谱峰进行鉴定，使用提取离子色谱图(XIC)功能对各色谱峰进行分析。结果显示，醋制可改变商陆正丁醇部位中不同皂苷的含量。商陆正丁醇部位醋制后，除EsA其余各皂苷类化合物峰面积均不同程度下降，商陆皂苷的组成发生明显变化，但未见新成分生成。, 百拇医药(郁红礼 张程超 吴皓 王奎龙 王卫 单雪莲)
[关键词]商陆； 商陆皂苷； 液质联用； HPLC； EsC； EsB；
商陆科有毒中药商陆Phytolacca acinosa Roxb或垂序商陆P americama L有逐水消肿的功能，主治水肿胀满、二便不通，临床应用广泛。但自《神农本草经》以来历代本草医书均记载为有毒，故临床使用其炮制品，以降低毒性缓和药性[1]。临床误服鲜品或生品，毒性表现中最为常见的腹痛、腹泻[24]，是商陆的主要毒副作用，但其毒性作用机制未明，而醋制后毒性明显下降[5]。课题组前期研究发现商陆正丁醇萃取部位具有强烈的刺激性，并能引起炎症和导致肠道腹泻，是商陆的主要毒性部位，其他部位未见明显毒性[67]。进一步研究表明正丁醇部位中多种皂苷类成分如商陆皂苷B、商陆皂苷C具有显著的致炎毒性[6]，能引起肠道水通道蛋白表达变化[8]。且可能与其引起肠道腹泻相关[911]。商陆有毒，历版《中国药典》亦以醋炙法炮制商陆，以缓和峻下逐水的作用。故本实验采用液质联用及HPLC研究醋制对商陆正丁醇部位皂苷类成分及主要毒性成分EsB和EsC醋制前后含量的影响，以期阐释商陆醋制解毒机制。
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液质联用：20DXR HPL系统(SHIMADZU公司，日本)；Triple TOFTM5600质谱仪(美国AB SCIEX公司)配有电喷雾离子源(ESI)。
Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Alltech 2000ES ELSD检测器；Purospher C18色谱柱(46 mm×250 mm，5 μm)；Labconco(6 L)冷冻干燥机(美国Labconco公司)SpringS15i超纯水发生器；KQ500DE型医用数控超声清洗器；Rotavapor R210旋转蒸发仪(BUCHI)；HH2K4二列四孔智能水浴锅(南京科尔仪器设备有限公司)；BP211D电子天平(德国Sartorius公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；美的电磁炉。
镇江香醋(江苏恒顺醋业股份有限公司，总酸550～599 g·L-1，批号20150723/A3)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司，批号20140122)；色谱甲醇(Scharlau公司，批号67561)。其余试剂均为分析纯。水为超纯水。
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2方法与结果
21样品制备
商陆正丁醇部位浸膏的制备：将生商陆10 kg，置于中药提取罐中，加入8倍量70%乙醇回流提取2 h，取出提取液，残渣加入6倍量70%乙醇回流提取1 h，重复上述操作，合并3次提取液，旋转蒸发仪减压浓缩，得醇浸膏。将商陆70%乙醇浸膏用适量水溶解，分别先以石油醚、二氯甲烷萃取，母液再加入4倍量水饱和正丁醇，萃取数次，合并萃取液，回收溶剂，冻干，得正丁醇浸膏。
醋制正丁醇部位浸膏的制备：取正丁醇浸膏100 g，根据商陆饮片炮制加醋量(每100 kg生商陆加醋30 kg)和正丁醇部位浸膏的得率(20%)，故加150 g食醋，100 ℃煮30 min，减压浓缩，冷冻干燥后得到醋制后正丁醇部位。
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醋商陆饮片自制，按照2015年版《中国药典》中醋炙法制得，即取净商陆100 g，加入30 g醋拌匀，闷润至醋被吸尽，文火炒干，晾凉。
商陆皂苷(esculentoside，Es)A，B，C，D，F均为实验室自制。
22醋制对商陆正丁醇部位中皂苷类成分含量的影响
221供试品溶液的制备取商陆正丁醇部位浸膏、醋制正丁醇部位浸膏适量，加甲醇制成1 g·L-1。
222色谱条件及质谱条件Purospher C18色谱柱；流动相甲醇(A)01%甲酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～5 min，35%～45%A；5～15 min，45%～60%A；15～25 min，60%A；25～30 min，60%～65%A；30～40 min，65%～80%A；40～55 min，80%A；55～56 min，80%～35%A；56～60 min，35%A)；流速为1 mL·min-1；柱温30 ℃。
采用电喷雾负离子模式检测，一级质谱参数：离子源气155 V；离子源气255 V；气帘气 40 V；离子源温度 550 ℃；TSVF -4 500V；除簇电压-60 V；碰撞能量-35 V；碰撞能量补偿 15 V。质谱扫描范围m/z 100～1 200。氮气为保护气和喷雾气。
223数据采集分析使用PeakviewTM软件进行数据采集和分析，得到精确的质量、母离子和碎片离子。通过比较目标对照品相对分子质量和保留时间对色谱峰进行鉴定，使用提取离子色谱图(XIC)功能对各色谱峰进行分析。结果显示，醋制可改变商陆正丁醇部位中不同皂苷的含量。商陆正丁醇部位醋制后，除EsA其余各皂苷类化合物峰面积均不同程度下降，商陆皂苷的组成发生明显变化，但未见新成分生成。, 百拇医药(郁红礼 张程超 吴皓 王奎龙 王卫 单雪莲)