穿心莲转录因子ApNAC1的克隆、亚细胞定位及原核表达(1)
[摘要]从穿心莲叶片中克隆了1个NAC家族的转录因子，命名为ApNAC1，GenBank注册号为KY196416。生物信息学分析表明该基因的完整编码区包含972 bp，编码1个323个氨基酸的多肽，预测蛋白相对分子质量为35.9 kDa，等电点为6.14。原生质体瞬时表达研究证实了ApNAC1-GFP融合蛋白特异定位在穿心莲叶肉细胞的细胞核中，是一个核定位蛋白。实时定量PCR结果表明ApNAC1基因表达与穿心莲内酯的积累模式一致：主要在穿心莲的叶片里表达，而且茉莉酸甲酯处理能急剧上调其表达水平。ApNAC1基因在大肠杆菌中进行异源表达，并且被成功纯化。该研究为进一步探索ApNAC1蛋白参与穿心莲内酯生物合成的研究奠定了基础。
[关键词] 穿心莲； NAC转录因子； 亚细胞定位； 表达模式； 原核表达
[Abstract] Andrographis paniculata is widely used as medicinal herb in China for a long time and andrographolide is its main medicinal constituent. To investigate the underlying andrographolide biosynthesis mechanisms， RNA-seq for A. paniculata leaves with MeJA treatment was performed. In A. paniculata transcriptomic data， the expression pattern of one member of NAC transcription factor family (ApNAC1) matched with andrographolide accumulation. The coding sequence of ApNAC1 was cloned by RT-PCR， and GenBank accession number was KY196416. The analysis of bioinformatics showed that the gene encodes a peptide of 323 amino acids， with a predicted relative molecular weight of 35.9 kDa and isoelectric point of 6.14. To confirm the subcellular localization， ApNAC1-GFP was transiently expressed in A. paniculata protoplast. The results indicated that ApNAC1 is a nucleus-localized protein. The analysis of real-time quantitative PCR revealed that ApNAC1 gene predominantly expresses in leaves. Compared with control sample， its expression abundance sharply increased with methyl jasmonate treatment. Based on its expression pattern， ApNAC1 gene might involve in andrographolide biosynthesis. ApNAC1 was heterologously expressed in Escherichia coli and recombinant protein was purified by Ni-NTA agarose. Further study will help us to understand the function of ApNAC1 in andrographolide biosynthesis.
, 百拇医药
[Key words] Andrographis paniculata； NAC transcription factor； subcellular localization； expression pattern； heterologous expression
穿心莲为爵床科Acanthaceae植物穿心莲Andrographis paniculata的干燥地上部分，味苦、性寒，具有清热解毒、消肿止痛、抗菌及抗癌作用[1-3]，临床应用于心血管系统疾病、呼吸系统疾病、胃肠道系统疾病等[4]。其抗炎抗感染的主要活性物质是二萜内酯类， 如穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯等[5]。
研究表明包括茉莉酸甲酯(MeJA)在内的多种诱导子可以刺激穿心莲内酯及其相关萜类化合物在穿心莲体内的积累[6-7]。为了阐明穿心莲体内合成机制，作者对MeJA不同诱导时间的穿心莲叶片进行了转录组测序。在转录组数据中，一个NAC转录因子家族成员的表达模式与穿心莲内酯的积累模式较为吻合：在MeJA处理12 h后急剧上升，在随后的24，48 h里都维持一个较高的表达水平。NAC转录因子超家族是植物中特有的转录因子家族，包含了众多成员。其N-端有一个高度保守的 NAC 结构域，具有DNA结合或蛋白质和二聚体结合功能；而其C-端无论是在氨基酸序列还是长度方面都具有高度的多样性，具有转录激活、抑制或者与蛋白质结合等功能[8]。NAC家族的转录因子参与了植物的发育、衰老、次生壁形成以及对外界生物和非生物胁迫的各种应答反应[9]。然而，NAC转录因子参与植物次生代謝却鲜见报道。为了探索新的调控萜类代谢的转录因子并增加对NAC转录因子调控功能的理解，本研究首次克隆得到了穿心莲NAC家族中的1个成员，命名为ApNAC1。, 百拇医药(王健 齐梦蝶 郭娟 申业 林慧馨 黄璐琦)
[关键词] 穿心莲； NAC转录因子； 亚细胞定位； 表达模式； 原核表达
[Abstract] Andrographis paniculata is widely used as medicinal herb in China for a long time and andrographolide is its main medicinal constituent. To investigate the underlying andrographolide biosynthesis mechanisms， RNA-seq for A. paniculata leaves with MeJA treatment was performed. In A. paniculata transcriptomic data， the expression pattern of one member of NAC transcription factor family (ApNAC1) matched with andrographolide accumulation. The coding sequence of ApNAC1 was cloned by RT-PCR， and GenBank accession number was KY196416. The analysis of bioinformatics showed that the gene encodes a peptide of 323 amino acids， with a predicted relative molecular weight of 35.9 kDa and isoelectric point of 6.14. To confirm the subcellular localization， ApNAC1-GFP was transiently expressed in A. paniculata protoplast. The results indicated that ApNAC1 is a nucleus-localized protein. The analysis of real-time quantitative PCR revealed that ApNAC1 gene predominantly expresses in leaves. Compared with control sample， its expression abundance sharply increased with methyl jasmonate treatment. Based on its expression pattern， ApNAC1 gene might involve in andrographolide biosynthesis. ApNAC1 was heterologously expressed in Escherichia coli and recombinant protein was purified by Ni-NTA agarose. Further study will help us to understand the function of ApNAC1 in andrographolide biosynthesis.
, 百拇医药
[Key words] Andrographis paniculata； NAC transcription factor； subcellular localization； expression pattern； heterologous expression
穿心莲为爵床科Acanthaceae植物穿心莲Andrographis paniculata的干燥地上部分，味苦、性寒，具有清热解毒、消肿止痛、抗菌及抗癌作用[1-3]，临床应用于心血管系统疾病、呼吸系统疾病、胃肠道系统疾病等[4]。其抗炎抗感染的主要活性物质是二萜内酯类， 如穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯等[5]。
研究表明包括茉莉酸甲酯(MeJA)在内的多种诱导子可以刺激穿心莲内酯及其相关萜类化合物在穿心莲体内的积累[6-7]。为了阐明穿心莲体内合成机制，作者对MeJA不同诱导时间的穿心莲叶片进行了转录组测序。在转录组数据中，一个NAC转录因子家族成员的表达模式与穿心莲内酯的积累模式较为吻合：在MeJA处理12 h后急剧上升，在随后的24，48 h里都维持一个较高的表达水平。NAC转录因子超家族是植物中特有的转录因子家族，包含了众多成员。其N-端有一个高度保守的 NAC 结构域，具有DNA结合或蛋白质和二聚体结合功能；而其C-端无论是在氨基酸序列还是长度方面都具有高度的多样性，具有转录激活、抑制或者与蛋白质结合等功能[8]。NAC家族的转录因子参与了植物的发育、衰老、次生壁形成以及对外界生物和非生物胁迫的各种应答反应[9]。然而，NAC转录因子参与植物次生代謝却鲜见报道。为了探索新的调控萜类代谢的转录因子并增加对NAC转录因子调控功能的理解，本研究首次克隆得到了穿心莲NAC家族中的1个成员，命名为ApNAC1。, 百拇医药(王健 齐梦蝶 郭娟 申业 林慧馨 黄璐琦)