2 方法

    2.1 SNP位點的筛选和引物设计 利用BioEdit软件对GenBank数据库中石斛属植物的ITS序列进行同源对齐，校对后分析铁皮石斛与近缘石斛物种差异SNP位点，利用Primer Premier 5.0软件设计铁皮石斛双阻滞位点特异性鉴别引物TPSH-AS1F/TPSH-AS1R，序列及PCR扩增程序见表2。

    2.2 基因组总DNA的提取和PCR扩增条件的确定 取100 mg干燥样品，研磨成细粉后，置于1.5 mL离心管中，加入65 ℃预热的CTAB沉淀液750 μL，充分震荡混匀，65 ℃温育40 min，低速离心5 min，弃去上清，剩下管内材料按改良CTAB法^[13]提取总DNA。取不同样品DNA，调整至浓度约30 mg·L^-1，用通用引物ITS1和ITS4进行PCR反应以检测模板DNA质量。PCR反应体系为2.5 μL 10×PCR Buffer，1 μL 10 mmol·L-1 dNTPs ......