莪术含药血清抑制HSCs中Shh和Gli1表达的机制研究(3)
2.5 MTT法检测HSCs增殖活性 HSCs按1×105个/mL接种于96孔板，每孔100 μL，分为7组，每组6个复孔。在37 ℃，5% CO2培养箱内用含10%胎牛血清的1640培养基孵育，24 h后弃上清，按分组条件加入干预因素作用24 h后，于各孔分别加入MTT溶液20 μL，4 h后弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪在490 nm 波长处测定各孔吸光度(A)。2.6 RT-PCR检测HSCs内Shh，Gli1的mRNA表达 HSCs按每孔5.0×105个/mL接种于6孔板，每孔2 mL，待细胞生长至80%～90%融合时，吸弃培养基，各组加入相应血清及试剂，24 h后收集细胞。提取细胞总RNA；PCR反条件为：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环，最后72 ℃延伸10 min。反应结束后取PCR产物15 μL于1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。实验过程中以GAPDH作内参对照。Shh，Gli1基因上下游引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成，见表1。
2.7 Western blot法检测HSCs内Shh，Gli1蛋白表达情况 HSCs接种、培养以及药物处理同2.6项 ......
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