女贞子对正常大鼠肝脏COX活性的影响及其DNA甲基化调节机制的初步研究(3)
2.6.3 分析 显色后用Quantity one分析软件分析条带灰度，以目的基因的条带灰度与内参β-actin的灰度比值表示蛋白的表达水平。
2.7 重亚硫酸盐法检测基因Cox4i1 DNA甲基化频率
2.7.1 DNA提取及重亚硫酸盐处理和纯化回收 取10～20 mg肝脏组织按Promega DNA提取试剂盒提取DNA。琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，全波长酶标仪测定DNA的纯度和浓度。提取后的DNA按照Epigenetics甲基化试剂盒说明书步骤得到甲基化DNA产物。
2.7.2 扩增和纯化回收 第一次PCR体系25 μL，甲基化DNA模板1.5 μL，Cox4i1上游引物1 μL，Cox4i1下游引物1 μL，GoTaq酶12.5 μL，Milliq水9 μL。反应条件：预变性94 ℃ 10 min，变性每次循环94 ℃ 1 min，退火60 ℃ 30 s及延伸72 ℃ 30 s，共35个循环，后延伸72 ℃ 10 min。第2次PCR体系25 μL，第1次PCR的DNA产物2 μL，Cox4i1上游引物1 μL，Cox4i1N下游引物1 μL，GoTaq酶12.5 μL，Milliq水8.5 μL。反应条件：预变性94 ℃ 5 min ......
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2.7 重亚硫酸盐法检测基因Cox4i1 DNA甲基化频率
2.7.1 DNA提取及重亚硫酸盐处理和纯化回收 取10～20 mg肝脏组织按Promega DNA提取试剂盒提取DNA。琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，全波长酶标仪测定DNA的纯度和浓度。提取后的DNA按照Epigenetics甲基化试剂盒说明书步骤得到甲基化DNA产物。
2.7.2 扩增和纯化回收 第一次PCR体系25 μL，甲基化DNA模板1.5 μL，Cox4i1上游引物1 μL，Cox4i1下游引物1 μL，GoTaq酶12.5 μL，Milliq水9 μL。反应条件：预变性94 ℃ 10 min，变性每次循环94 ℃ 1 min，退火60 ℃ 30 s及延伸72 ℃ 30 s，共35个循环，后延伸72 ℃ 10 min。第2次PCR体系25 μL，第1次PCR的DNA产物2 μL，Cox4i1上游引物1 μL，Cox4i1N下游引物1 μL，GoTaq酶12.5 μL，Milliq水8.5 μL。反应条件：预变性94 ℃ 5 min ......
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