2.2 基于Cyt b序列的哈蟆油位点特异性鉴别引物设计 从GenBank中下载得到中国林蛙、黑龙江林蛙、黑斑蛙、中华大蟾蜍、牛蛙Cytb序列。测序所得序列使用软件CodonCode Aligner校对拼接，去除引物区，将下载和测序获得序列使用BioEdit软件进行比对，筛选出哈蟆油基原物种中国林蛙特有的变异位点，根据变异位点使用Primer 5.0软件进行引物设计，在引物3′末端倒数第二位引入人为错配。设计出2对鉴别引物，分别命名为155S-F/155S-R(扩增片段约为530 bp)，698S-F/698S-R(扩增片段约为105 bp)，由Invitrogen 公司合成，序列见表2。

    2.3 PCR反应条件优化 根据引物的Tm及产物长度设置PCR反应的初始反应条件。取不同样品DNA用于确定快速PCR反应条件。PCR 反应在 S1000 型PCR仪上进行，反应体系和初始反应程序见表2。反应结束后取PCR 反应产物6 μL，加入 2 μL 6×Loading buffer 混匀后于GelRed染色的 1% 琼脂糖凝胶电泳 ......